Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer
Summary
Metafas att anafas övergång utlöses genom anafas-befrämjande komplex (APC / C)-beroende ubikitinering och påföljande destruktion av cyklin B. Här har vi etablerat ett system som, efter puls-chase märkning, medger övervakning cyklin B proteolys i hela cellpopulationer och underlättar detekteringen av störningar av den mitotiska kontrollpunkten.
Abstract
Jämn fördelning av kromosomer mellan de två dotterceller under celldelning är en förutsättning för att garantera genetisk stabilitet 1. Felaktigheter under kromosom separation är ett kännetecken för malignitet och i samband med progressiv sjukdom 2-4. Spindeln montering kontrollpunkten (SAC) är ett mitotiska övervakningsmekanism som håller tillbaka celler vid metafas tills varenda kromosom har etablerat en stabil bipolär anslutning till den mitotiska spindeln 1. SAC utövar sin funktion genom interferens med aktiverande APC / C-subenhet CDC20 att blockera proteolys av Sekurin och cyklin B och därmed kromosom separation och mitotisk avsluta. Felaktig fastsättning av kromosomer förhindrar tysta SAC signalering och orsakar fortsatt hämning av APC / C CDC20 tills problemet är löst för att undvika kromosom missegregation, aneuploidi och elakartade svulster 1.
De flesta studier som riktar den influence på felaktig kromosomal fastsättning på APC / C-beroende proteolysen utnyttjade spindel störningar med depolymerisering eller mikrotubuli-stabiliserande läkemedel för att störa kromosomal anknytning till mikrotubuli. Eftersom störningar mikrotubuli kinetik kan påverka transport och lokalisering av kritiska tillsynsmyndigheter, dessa förfaranden bär en risk för att inducera konstgjorda effekter 5.
Att studera hur SAC stör APC / C-beroende proteolysen av cyklin B under mitos i oberörd cellpopulationer har vi etablerat en histon H2-GFP-baserad system som tillät samtidig övervakning av metafas anpassning av mitotiska kromosomer och proteolys av cyklin B 6 .
Att skildra proteolytiska profiler, genererade vi en chimär cyklin molekyl B reporter med en C-terminal SNAP delen 6 (figur 1). I en egen märkning reaktionen är SNAP-gruppen kan bilda kovalenta bindningar medalkylguanin-bärare (SNAP-substrat) 7,8 (Figur 1). SNAP substratmolekyler är lätt tillgängliga och bär ett brett spektrum av olika fluorokromer. Chimära cyklin B-SNAP molekyler blir märkt vid tillsats av membran-permeabla SNAP substrat till odlingsmediet 7 (figur 1). Efter märkningsreaktionen faller cyklin B-SNAP fluorescensintensitet i en puls-chase reaktion-liknande sätt och fluorescensintensiteter återspeglar nivåerna av cyklin B nedbrytning 6 (figur 1). Vårt system underlättar övervakningen av mitotisk APC / C-beroende proteolys i ett stort antal celler (eller flera cellpopulationer) parallellt. Därigenom kan systemet vara ett värdefullt verktyg för att identifiera ämnen / små molekyler som kan störa proteolytisk aktivitet vid metafas att anafas övergång. Dessutom har som syntes av cyklin B under mitos nyligen föreslagits som en viktig mechanism främja en mitotiskt block i möss och människor genom att hålla cyklin B uttrycksnivåer stabila 9,10, gjorde detta system oss att analysera cyklin B proteolys som en del av en balanserad jämvikt 6.
Protocol
Discussion
Vi presenterar här en live-cell imaging strategi underlättar samtidig övervakning av cyklin B proteolys och kromosom inriktning. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att studera mitotiska kontroll i ostörda cellpopulationer på den enda cellnivå. Cyklin B nedbrytning kurvor underlätta direkta insikter i aktiviteten av APC / C och därmed indirekt återspeglar status SAC 6.
Detta tillvägagångssätt, även om fastställts baserat på Scan ^ R programvara kan enkelt r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för S. Taylor för att ge pLPCX-histon H2-GFP plasmid. Vi tackar R. Mertelsmann för fortsatt stöd. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
Riferimenti
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
