En praktisk og Novel metode til at udvinde Genomisk DNA fra Blood Collection Kits til Plasma Protein Preservation

Summary

Vi beskriver en ny fremgangsmåde til isolering af genomisk DNA fra fuldblod ved plasma / serologi. Efter plasma kollektion er den komprimerede blodet normalt kasseres. Vores hidtil ukendte fremgangsmåde udgør en betydelig forbedring i forhold til eksisterende metoder og gør DNA og plasma fås fra en enkelt samling, uden at anmode om yderligere blod.

Abstract

Laboratorieundersøgelser kan gøres på de cellulære eller flydende dele af blodet. Anvendelsen af ​​forskellige blodopsamlingsrør bestemmer del af blodet, der kan analyseres (fuldblod, plasma eller serum). Laboratorier involveret i at studere den genetiske grundlag af menneskelige lidelser er afhængige af antikoaguleret fuldblod opsamlet i EDTA-holdige Vacutainer som kilde af DNA til genetisk / genomisk analyse. Fordi de fleste kliniske laboratorier udfører biokemiske, serologiske og viral afprøvning som et første skridt i fænotypisk udfald undersøgelse, antikoaguleret blod også opsamlet i heparin-holdige rør (plasma rør). Derfor når DNA og plasma er nødvendige for samtidige og parallelle analyser af både genomiske og proteomiske data, er det almindeligt at samle blod i både EDTA og heparin rør. Hvis blod kan indsamles i et enkelt rør, og tjene som en kilde til både plasma og DNA, ville denne metode blive betragtet som en avancement til eksisterende methods. Brugen af ​​den komprimerede blod efter plasma udvinding repræsenterer en alternativ kilde til genomisk DNA, og dermed minimere mængden af ​​blod behandlede prøver og reducere antallet af nødvendige prøver fra hver patient. Dette ville i sidste ende spare tid og ressourcer.

BD P100 blodtapning system til plasmaprotein konservering blev oprettet som en forbedret metode i forhold til tidligere plasma eller serum samling rør ^1, for at stabilisere proteinindholdet i blodet, så bedre protein biomarkør opdagelse og proteomics eksperimenter fra humant blod. BD P100 rør indeholder 15,8 ml spraytørret K2EDTA og en frysetørret proprietære bredspektret cocktail af proteaseinhibitorer for at hindre koagulation og stabilisere plasmaproteiner. De omfatter også en mekanisk separator, som giver en fysisk barriere mellem plasma og cellebundfald efter centrifugering. Kun få metoder er blevet udviklet til at udvinde DNA fra størknet blod samples indsamlet i gamle plasma rør ^2-4. Udfordringer fra disse metoder blev primært forbundet med den type separator inde i rørene (gel separator) og omfattede vanskeligt inddrive størknet blod, besværet med fragmentering eller dispergering af blodprop, og obstruktion af blodprop ekstraktion ved separation gelen.

Vi præsenterer den første metode, som trækker og renser genomisk DNA fra blod trukket i de nye BD P100 rør. Vi sammenligne kvaliteten af ​​DNA-prøven fra P100 rør til at fra EDTA-rør. Vores tilgang er enkel og effektiv. Det indebærer fire store trin som følger: 1) brug af et plasma BD P100 (BD Diagnostics, gnister, MD, USA) rør med mekanisk separator for blodprøvetagning, 2) fjernelse af den mekaniske separator ved hjælp af en kombination af saccharose og en steril papirclips metallisk krog, 3) udskillelse af buffy coat lag indeholdende de hvide celler og 4) isolering af genomisk DNA fraBuffy coat hjælp af en almindelig kommerciel DNA ekstraktion kit eller en lignende standard protokol.

Protocol

1.. Sample Collection Saml blodprøver fra personer med ordentlig informeret samtykke. For hvert individ, uafgjort 4 til 5 ml blod i en P100 rør (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). Til sammenligningsformål indsamle samtidig blod i et EDTA rør. BD P100 rør indeholder 15,8 ml spraytørret K2EDTA og et frysetørret proprietære bredspektret cocktail af proteasehæmmere for at hindre koagulation og stabilisere plasmaproteiner. De indeholder også en mekanisk separator. Efter opsamling af fuldb…

Representative Results

DNA kvalitetsvurdering og koncentrationsmåling Udbytterne af P100_DNAs var betydeligt lavere end EDTA_DNAs (tabel 1 og 2). DNA renheden repræsenteret ved sin 260/280 forholdet værdi er den samme for både P100_DNA og EDTA_DNA prøvesæt (tabel 1 og 2). Kvaliteten af DNA'et er ret ensartet inden for hvert sæt prøve selvom nogle nedbrydning ses i EDTA_DNA prøver, som indikeret af lys smear (figur 2). De…

Discussion

Mange menneskelige sygdomme har genetiske årsager og udforske det genetiske grundlag for sygdomme hos mennesker kræver en stigende høj kvalitet DNA. Den mest almindelige kilde af DNA, der anvendes i genetiske undersøgelser er antikoaguleret fuldblod. Fordi de fleste kliniske laboratorier udfører biokemiske, serologiske og viral afprøvning som et første skridt i fænotypisk udfald undersøgelse, blodet ofte opsamles i et plasma rør. Efter opsamling af plasmaet, er den komprimerede blod ofte kasseres. Derfor, når…

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number
BD P100 tubes	BD Diagnostics	366448
EDTA tubes	BD Diagnostics	367863
Sucrose	Sigma	S9378
Paper clip	Office product
15 ml tube	Corning	430052
Red blood cells (RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
1.7 ml microtubes	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Bead array reader	Illumina	NA
GenomeStudio Software	Illumina	N/A