Un metodo pratico e innovativo per estrarre il DNA genomico da kit di raccolta del sangue per Plasma Proteina Preservation

Sommario

Stiamo descrivendo un nuovo procedimento per isolare DNA genomico da sangue intero prelevato per plasma / sierologia. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene solitamente scartata. Il nostro nuovo metodo rappresenta un miglioramento significativo rispetto ai metodi esistenti e rende il DNA e plasma disponibili da una singola collezione, senza richiedere ulteriore sangue.

Abstract

Test di laboratorio possono essere praticati sulle porzioni cellulari o fluido del sangue. L'uso di diverse provette determina la porzione del sangue che può essere analizzato (sangue intero, plasma o siero). Laboratori coinvolti nello studio delle basi genetiche delle malattie umane si basano su anticoagulante del sangue intero prelevato in EDTA contenente vacutainer come fonte di DNA per l'analisi genetica / genomica. Perché laboratori clinici di eseguire più test biochimici, sierologici e virali come un primo passo in un'indagine risultato fenotipico, il sangue coagulato è anche raccolto in provetta contenente eparina (tubo plasma). Pertanto quando sono necessarie DNA e plasma per analisi simultanea e parallela di dati sia genomici e proteomici, è consuetudine per raccogliere il sangue in EDTA e sia con eparina. Se sangue potrebbe essere raccolto in un unico tubo e servire come fonte sia per plasma e DNA, tale metodo sarebbe considerato un avanzamento a met esistentiods. L'utilizzo del sangue compattato dopo estrazione plasma rappresenta una fonte alternativa per il DNA genomico, minimizzando così la quantità di campioni di sangue trasformati e riducendo il numero di campioni richiesti da ogni paziente. Ciò finirebbe per risparmiare tempo e risorse.

Il P100 sistema di raccolta del sangue BD per la conservazione delle proteine ​​del plasma sono stati creati come un metodo migliorato nel corso del plasma precedente o raccolta siero tubi ^1, per stabilizzare il contenuto proteico del sangue, consentendo una migliore proteina scoperta di biomarcatori e proteomica sperimentazione dal sangue umano. I tubi P100 BD contengono 15,8 ml di K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine ​​plasmatiche. Essi includono anche un separatore meccanico, che fornisce una barriera fisica tra plasma e pellet cellulari dopo centrifugazione. Pochi metodi sono stati studiati per estrarre il DNA da sangue coagulato SAmples raccolti nei vecchi tubi di plasma ^2-4. Sfide da questi metodi sono stati principalmente associati con il tipo di separatore all'interno dei tubi (separatore di gel) ed inclusi difficoltà di recupero del sangue coagulato, l'inconveniente di frammentare o disperdendo il coagulo e ostruzione del coagulo estrazione dal gel di separazione.

Vi presentiamo il primo metodo che estrae e purifica il DNA genomico da sangue prelevato nei nuovi P100 tubi BD. Si confronta la qualità del campione di DNA da P100 tubi, a quella in provette EDTA. Il nostro approccio è semplice ed efficiente. Si tratta di quattro fasi principali, come segue: 1) l'uso di un BD P100 plasma (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tubo con separatore meccanico per la raccolta del sangue, 2) la rimozione del separatore meccanico utilizzando una combinazione di saccarosio e di un sterile graffetta gancio metallico, 3) la separazione dello strato di buffy coat contenente le cellule bianche e 4) l'isolamento del DNA genomico dalbuffy coat utilizzando un kit di estrazione del DNA normale commerciale o un protocollo standard simile.

Protocollo

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogliere campioni di sangue di soggetti con adeguata consenso informato. Per ogni individuo, trarre 4-5 ml di sangue in una provetta P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). A scopo di confronto, raccogliere contemporaneamente il sangue in una provetta con EDTA.
2. I tubi P100 BD contengono 15,8 ml K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine ​​plasmatiche. Essi contengono anche un separatore meccanico. Dopo aver raccolto il sangue intero, mantenere entrambi i tubi a temperatura ambiente per 60 min a tutta la notte fino al verificarsi di elaborazione.
3. Centrifugare le provette BD P100 a 2.500 g per quindici minuti a temperatura ambiente. Trasferire il plasma raccolto sopra il separatore meccanico in provette da centrifuga micro.
4. P100 Conservare le provette, contenente il sangue compattato sotto il separatore, a -80 ° C fino a quando si è pronti per iniziare il DNA extraction.

2.1 Dal sangue di P100 tubo (P100_DNA)

1. Le P100 tubi sono conservati a -80 ° C dopo l'estrazione del plasma. Entro 3 a 4 mesi, recuperare la provetta contenente il sangue P100 compattato dal congelatore e scongelare a 37 ° in un bagno d'acqua per 5 minuti (Figura 1A). Rimuovere eventuali residui di plasma che si trova sopra il separatore. Aggiungere 2 ml di soluzione di saccarosio al 17% (soluzione gradiente testato in casa - dati non pubblicati) nelle P100 tubi sopra il separatore (Figura 1B). Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 20 min a 2500 g; questo processo spinge il separatore meccanico per la parte superiore del tubo e produce tre strati di soluzione compreso il buffy coat (Figura 1C). Estrarre manualmente il separatore utilizzando una graffetta metallica uncinata steriled (Figura 1D).
2. Dopo aver recuperato il separatore meccanico da ogni tubo (Figura 1D), rimuovere e discard dello strato di saccarosio superiore. Trasferire lo strato centrale, che rappresenta il livello di buffy coat (BC), in una sterile 15 ml tubo conico. Aggiungere Tampone fosfato salino (PBS) per aumentare il volume buffy coat a 3 ml. Estrarre il DNA dal buffy coat utilizzando reagenti dalla Qiagen Puregene Kit Sangue come da indicazioni del produttore, eccetto una velocità di centrifugazione di 2500 g (invece di 2.000 g).
3. Per lisare e rimuovere i globuli rossi (RBC), aggiungere 9 ml di RBC lisi a 3 ml di buffy coat. Capovolgere ogni provetta diverse volte e incubare a temperatura ambiente per 10 min, con occasionale invertente durante l'incubazione. Spin ogni miscela fino a 2.500 g per 5 minuti e scartare il surnatante. Trattare il restante pellet in ogni provetta con 3 ml di soluzione di lisi cellulare e vortex per 15 sec. Trattare il lisato con 1 ml di soluzione di precipitazione proteica e vortex per 15 sec.
4. Centrifugare a 2500 g per 5 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 15 ml contenente3 ml di isopropanolo al 100%. Invertire i nuovi tubi di 10 volte e centrifugare a 2500 g per 3 min. Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di etanolo al 70%. Invertire i tubi conici un paio di volte per rimuovere e lavare il pellet di DNA. Centrifugare a 2500 g per 1 min. Lasciar seccare il precipitato per 3 min (posizionare il tubo capovolto) a temperatura ambiente e quindi sospendere il DNA con 250 ml di soluzione di reidratazione a 37 ° C per 10 min e il trasferimento ad un pre-etichettato 1,7 ml provetta. Conservare le provette a -80 ° C fino all'utilizzo.

2.2 da sangue di EDTA Ttube (EDTA_DNA)

1. Il sangue intero per i test di routine immunoematologia viene raccolto in provette di plastica vaccutainer spruzzo-rivestito con 10,8 mg di K ₂ EDTA e conservati a -80 ° C. Poiché i tubi non contengono un separatore meccanico, l'estrazione del DNA non include le fasi che coinvolgono il separatore meccanico (2.1.1 e 2.1.2).
2. Entro 3-4 mesi di conservazione del sangue, il DNA viene estratto utilizzando il martin pescatore Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Si tratta di un sistema di estrazione del DNA di automazione basati su tecnologia di particelle magnetiche ed è costituito da cellule di lisi / DNA vincolanti, diverse fasi di lavaggio e di eluizione del DNA.
3. Il kit utilizzato per l'estrazione del DNA è il martin pescatore Flex 24 DNA del sangue kit (Qiagen, Germania).

3. DNA Quantità e valutazione della qualità

La quantità, la qualità e l'integrità del DNA genomico sono stati valutati da una combinazione di metodo che comprende PicoGreen, spettroscopia e elettroforesi.

1. La concentrazione del DNA genomico è determinata dalla quantificazione Nanodrop e PicoGreen.
2. La purezza è determinata dalla misurazione 260/280 rapporto sullo spettrofotometro Nanodrop.
3. Il campione (500 ng) è anche caricato su gel di agarosio 1% per valutare l'integrità (degradazione) del DNA.

4. Genotyping saggi e controllo di qualità

1. Cinque P100_DNA e loro corrispondenti campioni EDTA_DNA sono scelti a caso per ulteriori analisi utilizzando la Immunochip personalizzato (Immuno DNA Analysis BeadChip). Immunochip è un chip di genotipizzazione Infinium contenente 196.524 polimorfismi ed è progettato per gli studi immunogenetici ^5.
2. Per ciascun campione, 200 ng di DNA è amplificato, frammentata, precipitato e risospeso in tampone di ibridazione appropriate.
3. I campioni denaturati sono ibridate su Immunochips a 48 ° C per un minimo di 16 ore.
4. Dopo l'ibridazione, i Immunochips sono trattati per le reazioni di estensione singolo-base e macchiati.
5. Le immunochips vengono poi ripreso con lettore di serie Illumina HISCAN Bead ei dati di intensità di perline normalizzati vengono caricati nel software Illumina GenomeStudio e convertiti in genotipi. I genotipi sono chiamate utilizzando l'algoritmo autocalling di GenomeStudio. Il controllo di qualità individeranno in esclusione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), con un tasso di chiamata <95%.
6. Il tasso di chiamata SNP è utilizzato come misura dell'efficienza dosaggio immunochip. Esso è calcolato come percentuale del numero totale di saggi sul chip (196.524 SNP codificati su ogni chip) che realizzano sufficiente intensità e qualità del segnale per ricevere un'assegnazione genotipo automatizzato. DNA di alta qualità (260/280 rapporto di 1,8 o superiore e assenza di degradazione) è previsto per conseguire almeno lo stesso tasso di chiamata come il DNA di controllo HapMap inclusa nel saggio immunochip. Il controllo di qualità comporta l'esclusione di SNPs con un tasso di chiamata <95% in ogni set di dati.

Risultati

Valutazione della qualità del DNA e la misura della concentrazione

Le rese di P100_DNAs erano significativamente inferiori a quelli di EDTA_DNAs (Tabelle 1 e 2). La purezza del DNA rappresentata dal valore 260/280 rapporto è simile per entrambi P100_DNA e set di esempio EDTA_DNA (Tabelle 1 e 2). La qualità del DNA è abbastanza uniforme all'interno di ogni serie di campioni sebbene alcuni degradazione è visto nei campioni ED...

Discussione

Molte malattie umane hanno cause genetiche ed esplorare la base genetica delle malattie umane richiede una crescente DNA di alta qualità. La fonte più comune di DNA utilizzato in studi genetici è coagulato sangue intero. Poiché laboratori più eseguire test biochimici clinici, sierologici, e virali come primo passo in esito indagine fenotipica, il sangue viene spesso raccolta in un tubo plasma. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene spesso scartato. Pertanto, quando il DNA è necessario per condurre studi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi BD P100	BD Diagnostics	366448
Tubi EDTA	BD Diagnostics	367863
Saccarosio	Sigma	S9378
Clip per fogli	Prodotto da ufficio
Tubo da 15 ml	Corning	430052
Emazie (globuli rossi, RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Buffer salino fosfato (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
Micotubi da 1,7 ml	Axygen	MCT-175-C
Kit Human Immuno DNA Analysis BeadChip	Illumina	WG-352-1001
Lettore di matrici a perline	Illumina	NA
Software GenomeStudio	Illumina	N/A