Den kraniel mesenkym undergår dramatiske morfogene bevægelser, der sandsynligvis giver en drivkraft for elevation af de neurale folder<sup> 1,2</sup>. Her beskriver vi en enkel<em> Ex vivo</em> Eksplanteres assay til at karakterisere de cellulære adfærd af den kranielle mesenkym under neurulation. Denne analyse har talrige anvendelser, herunder at være modtagelige for farmakologiske manipulationer og levende billeddiagnostiske analyser.
Centralnervesystemet er afledt af den neurale plade, der gennemgår en række komplekse morfogenetiske bevægelser resulterer i dannelse af neuralrøret i en proces kendt som neurulation. Under neurulation bliver morfogenese af mesenkymet der ligger til grund for neurale plade menes at drive neural fold elevation. Den kraniale mesenkym består af den paraksiale mesoderm og crista neuralis celler. Cellerne af den kraniale mesenkym danner en pourous meshwork sammensat af stjerneformige formede celler og sammenblanding ekstracellulær matrix (ECM) tråde, der understøtter de neurale folder. Under neurulation undergår kraniel mesenkym stereotype rearrangementer resulterer i sin ekspansion og disse bevægelser menes at tilvejebringe en drivkraft for neural fold elevation. Forbliver dog de veje og cellulære adfærd, der driver kraniel mesenkym morfogenese dårligt undersøgt. Interaktioner mellem ECM og cellerne i de kraniale mesenchym ligge til grund THESe celle adfærd. Her beskriver vi en simpel ex vivo eksplantat assay udviklet til at karakterisere adfærd af disse celler. Dette assay kan ændres til farmakologiske manipulationer at dissekere signalveje involveret og levende billeddannende analyse for yderligere at karakterisere adfærden af disse celler. Vi præsenterer et repræsentativt forsøg viser anvendeligheden af dette assay til at karakterisere de vandrende egenskaber af den kraniale mesenkym på forskellige ECM-bestanddele.
Neuralrøret lukning i skallepartiet forekommer mellem fosterdag 8,5 (E8.5) og 9,5 i museembryo. Manglende korrekt lukke neuralrøret i hovedet resulterer i anencephalitis, et fælles strukturelt misdannelse hos mennesker og er uforenelig med livet. De kræfter, der driver cephalic neuralrøret lukning frembringes fra både nervevæv selv og det omgivende epidermis og mesenkym 3. Især udvidelse af kraniale mesenkym menes at være afgørende for elevation af det kraniale neurale folder 1,2. Den kraniale mesenkym er rig på ECM-proteiner især glycosylerede proteiner, såsom heparin sulfat proteoglycaner, chondroitin-sulfater og hyaluronat 4-8.
Til forskel i kyllingefoster hvor neural crest-celler emigrere fra den dorsale neuralrøret efter neuralrøret lukning, migrerer det crista neuralis i museembryo på samme tid, at de neurale folder begynder at rise (efter 5 somit fase). Således under neurulation i museembryo, er den kraniale mesenkym bestående af celler afledt fra crista neuralis og paraksiale mesoderm. Neural våbenskjold og akseparallelle mesoderm populationer induceres på forskellige tidspunkter i udviklingen, lokaliseret i forskellige positioner i embryoet og udvikle sig til forskellige strukturer 9,10. Den paraksiale mesoderm stammer fra primitivstriberne og migrerer til det forreste område af embryonet til grund for den formodede neurale plade. Den crista neuralis induceres ved forbindelsen mellem den neurale plade og epidermal ectoderm, undergår en epiteloverflade med mesenkym overgang og delaminerer lige før neurale fordoblet stigning i gnaver embryo. Neuralkam celler migrerer langs stereotype stier i subectodermal paraksial mesoderm til brankiebue, frontonasal og periokulær mesenchym. Den paraksiale mesoderm vil bidrage til nogle af knoglerne i kraniet hvælving og muskler i ansigtet, og at the neuralkam vil bidrage til andre knogler i kraniet og ansigtet i tillæg til kranienerver 9-11. Den paraksiale mesoderm og crista neuralis slægter kan være differentielt mærket med Mesp1-cre og Wnt1-Cre transgene muselinjer, henholdsvis 9.
Den væsentlige rolle kraniale mesenkym i neuralrøret lukning er blevet udledt fra forsøg, hvor behandling af gnavere embryoner med ECM forstyrre midler, såsom hyaluronidase, chondroitinase ABC, heparitinase eller Diazo-oxo-norleucin (DON) under neurulation nedsat neuralrøret lukning 7, 12-14. I disse eksperimenter viste histologisk analyse af statiske sektioner efter neurulation forbundet dysmorphogeneis af den kraniale mesenkym 7,12-14. Men da den teratogene agent havde adgang til flere væv, er det stadig skal bestemmes, hvis den kranielle mesenkym er virkelig målvævet. Til støtte for den konklusion, at dette væver afgørende for neurulation, den kraniale mesenkym forekommer unormalt ved histologiske analyser i nogle mus mutanter med exencephali 15-17. Stadig i de fleste tilfælde er virkningen af mutationen på den cellulære opførsel kraniale mesenkym ikke blevet behandlet.
Vi har udtænkt en ex vivo explant assay til direkte undersøgelse af følge af genetisk mutation eller farmakologisk manipulation på adfærden hos kraniale mesenchym-celler 15. Dette assay svarer til publiceret af Tzahor et al 2003 få adgang til differentieringspotentiale af den kraniale mesenkym der ligger til grund for rhombomeres 18 bortset vi har modificerede eksplantatet dissektion for at studere den migrerende egenskaber mere anteriore populationer af kranial mesenkym der ligger bag den forreste neurale plade. Vores fremgangsmåde er også en ændring af eksplantations assays udføres i kyllingefoster at analysere vandrende adfærd crista neuralis med key forskelle. Tidligere forberedelser er eksplanteret den neurale kam eller den mere posterior paraksiale mesoderm 19,20. Desuden skal der ved neural fold elevation i kyllingefoster har crista neuralis endnu udvandrede fra den dorsale neuralrøret og dermed eksplantater taget af den forreste akseparallelle mesoderm vil ikke indeholde crista neuralis celler. I vores assay craniale mesenchym eksplantater bestående af akseparallelle mesoderm, crista neuralis og overflade ektoderm fremstillet og udpladet på et substrat. Eksperimentel manipulation, herunder isolering af eksplantater fra genetiske mutanter, udpladning eksplantater på forskellige ECM eller farmakologiske behandlinger kan udføres. Celler vandrer fra eksplantatet og afstanden, antal og adfærd kan analyseres og sammenlignes mellem behandlingsgrupperne. Desuden er denne forberedelse kan ændres til analyser af cellulær migration ved levende billeddannelse teknikker. Efter migration eksperimentet, kan eksplantater fastsættes og underkastes immunhistokemiske analyser pelsther belyse virkningen af behandlinger. I det hele taget, er den protokol, der præsenteres her en simpel ex vivo assay for at undersøge opførslen af den kraniale mesenkym. Som et repræsentativt eksperiment, benytter vi denne analyse til at undersøge migration af kranie mesenkym på forskellige ekstracellulære substrater.
Den anvendte metode her giver et stærkt analyse for at undersøge opførslen af kranie mesenchym celler. Ud over de statiske analyser præsenteres her, imaging eksperimenter lever i lyse område eller i kombination med ekspression af GFP-mærkede proteiner kan anvendes til at undersøge adfærd af celler i realtid, når de trækker fra eksplantatet. For levende billeddannende eksperimenter, kan eksplantater mærkes med Dil eller at differentiere migration af crista neuralis fra paraksiale mesoderm, ROSA-YFP, Mesp1-cre eller ROSA-YFP, Wnt1-cre eller andre transgene linier kan anvendes. Kraniale mesenkym-ECM interaktioner kan også undersøges under anvendelse af dette eksplantat assay. Her vi plade eksplantater på forskellige ECM-substrater, som er til stede i den kraniale mesenkym at vise, at cellerne migrerer på disse i forskellig grad, og at ECM påvirker cellernes morfologi. Endvidere kan eksplantater være indlejret i en tredimensional matrix til at få adgang til adfærd af cells i denne sammenhæng. Denne eksplantat assay kan ændres til analyse af effekten af genetiske og farmakologiske manipulationer på kranienerver mesenchym adfærd at analysere interne og eksterne tidskoder, der kan regulere og ændre migration. For eksempel anvendte vi dette assay i vores undersøgelser at skelne rollen af overskydende Hsp90 sekretion i den unormale cellulære adfærd i Hectd1 mutant kraniel mesenkym 15. I disse eksperimenter behandledes vi eksplantater med anti-Hsp90-antistof, Hsp90 protein, geldanamycin og DMA (dimethyl amelioride) for at blokere sekretionen af Hsp90 at vise, at unormal opførsel Hectd1 mutantceller skyldes overskydende ekstracellulær Hsp90 15. Lignende fremgangsmåder kan anvendes til farmakologisk dissekere flere veje underliggende normalt og unormalt morfogenese af den kraniale mesenkym. Når assayet er udført, kan eksplantater og migrerende celler analyseres ved en række metoder. For eksempel immunohistokemiske analyser cen anvendes til at undersøge lokalisering af proteiner kritiske til celle bevægelser. Transkriptomet analyser kan også anvendes til at bestemme, hvordan behandlingerne påvirker genekspression.
En væsentlig begrænsning ved denne teknik er, at den ikke model adfærd i tre dimensioner, som de ville forekomme in vivo. Ændring af protokollen, hvor eksplantater er indlejret i en tre-dimensionel matrix (f.eks matrigel) sammen med ekspression af fluorescerende protein-mærkede cellulære rum kunne anvendes nødvendige for at løse dette problem. Selv om disse ændringer blev udført, ville yderligere forsøg for at korrelere adfærd ses i denne ex vivo-assay med de in vivo være nødvendig. Andre begrænsninger medregnet det store antal af embryoner, der er nødvendige for at generere et tilstrækkeligt antal til at generere statisk signifikante data. Vigtigst er det, dissektion er relativt enkel, det kræver øvelse at mestre.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde understøttes af R01-HD058629 til IEZ