Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu
Summary
Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için tasarlanmıştır<em> O</em>-GlcNAz. Her bir azid grubu chemoselectively viral yüzey değiştirme aracı olarak "ı" kimyası reaksiyon yoluyla ligate edilir.
Abstract
Virüs partiküllerinin modifikasyonu gen tedavisi, onkolitik uygulamaları ve aşı geliştirme etkileyen yönelik muazzam bir potansiyele dikkat önemli bir miktar aldı. Çoğunlukla genetik tabanlı olduğu viral yüzeyler, değiştirmek amacıyla 1,2,3 Şu yaklaşımlar genellikle zayıflama muzdarip virüs üretim, enfektivite ve hücresel iletimi. 4,5 Kemoselektif click kimyası kullanarak, son derece esnek ve erişilebilir hem de kalan süre bu konularda sidesteps basit bir alternatif yaklaşım geliştirdik. 1,2
Bu protokolün amacı adenovirüs tip 5 parçacıkların yüzey değiştirme bioorthogonal tıklama kimyası ile etkinliğini göstermektir. Bu proteinler üzerine hedef moleküllerin, boyalar veya ilgi diğer moleküllerin Kemoselektif ligasyonu sağlayan bu iki adımlı süreç hem terapötik 1 veya analitik, 2,6 kullanılabilirazid etiketleri ile önceden etiketli. Bu yöntemin üç büyük avantajları (1) metabolik etiketleme viral spor üzerinde hiçbir etkisi, 1,7 az gösteriyor ki vardır (2) efektör ligandlar geniş bir yelpazede kullanılabilir, ve (3) oldukça hızlı, güvenilir ve kolay erişim. 1,2,7
Bu işlemin ilk adımda, adenovirüs partikülleri işlevsel bir azid (N-3) içermesi, her ikisi de azidohomoalanine (Aha, bir metiyonin vekil) veya doğal olmayan bir şeker O-bağlı N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ya taşıyan üretilir grubu. Azid-modifiye edilmiş virüs partiküllerinin saflaştırıldıktan sonra, flüoresan TAMRA parçasını içeren bir prob alkin önceden etiketlenmiş proteinleri veya glikoproteinleri bir Kemoselektif şekilde ligate edilir. Son olarak, bir SDS-PAGE ile analiz viral proteinlerin kapsid üzerine prob başarılı ligasyonu göstermek için gerçekleştirilir. Aha dahil tüm viral kapsid etiketlemek için gösterilirproteinleri (Hexon, Penton ve Fiber), sadece Fiber etiketlenmesi O-GlcNAz birleştirmeyecektir ederken.
Bu gelişen alanında, azid-alkin ligasyonu için birden çok yöntem başarıyla geliştirilmiştir, ancak biz en uygun olduğu tespit sadece iki tanesini burada gösterilmiştir – strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) ve bakır-katalize azid-alkin Siklokatılma (CuAAC) deoxygenated atmosferi altında.
Protocol
Discussion
Azidler olanlar dahil Kemoselektif ve bioorthogonal tıklayın reaksiyonlar, gelişimi bir araştırma hızla gelişen bir alandır ve sonradan bioconjugation uygulamalar için seçim için bu reaksiyonlar giderek artan sayıda vardır. Biz kendi laboratuar ve tüm reaktifler ticari durumu çünkü onların kullanışlılığı seçildi yalnızca iki yöntem eklemek için bu protokol kapsamında sınırlama getirdik.
Bu tür ilk rotada – strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) – alkin …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz finansman (CBET-0.846.259) için NSF kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Riferimenti
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced “Clickable” Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimica. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
