Kemoselektiv Ändring av virala ytor via Bioorthogonal Klicka Kemi
Summary
Adenoviruspartiklar är konstruerade för att innehålla antingen det onaturliga aminosyra azidohomoalanine-analog eller azido socker<em> O</em>-GlcNAz. Azidgruppen för vardera kemoselektivt ligeras via "klicka" kemi reaktioner som ett sätt att viral ytmodifiering.
Abstract
Ändringen av viruspartiklar har fått en betydande uppmärksamhet för sin enorma potential för att påverka genterapi, onkolytiska applikationer och utveckling av vaccin. 1,2,3 Nuvarande metoder för att modifiera virala ytor, som oftast genetik-baserade, ofta lider av dämpning av virus produktion, smittsamhet och cellulära transduktion. 4,5 Använda kemoselektiv klick kemi, har vi utvecklat en enkel alternativt tillvägagångssätt som undviker dessa frågor samtidigt som den är både mycket flexibel och tillgänglig. 1,2
Målet med detta protokoll är att visa effektiviteten av att använda bioorthogonal klicka kemi för att modifiera ytan av adenovirus typ 5 partiklar. Denna två steg kan användas både terapeutiskt 1 eller analytiskt, 2,6 eftersom det möjliggör kemoselektiv ligering av målmolekyler, färgämnen eller andra molekyler av intresse på proteinermärkt i förväg med azid taggar. De tre stora fördelarna med denna metod är att (1) metabolisk märkning visar liten eller ingen effekt på viral fitness, 1,7 (2) ett brett utbud av effek-ligander kan användas, och (3) Det är otroligt snabb, pålitlig och lätt att nå. 1,2,7
I det första steget av detta förfarande, är adenoviruspartiklar produceras som bär antingen azidohomoalanine (Aha, en metionin surrogat) eller den onaturliga socker O-kopplad N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), vilka båda innehåller aziden (-N3) funktionell grupp. Efter rening av de azid-modifierade viruspartiklar, är en alkyn-prob innehållande den fluorescerande TAMRA-delen ligerades i en kemoselektiv sätt att de pre-märkta proteiner eller glykoproteiner. Slutligen är en SDS-PAGE-analys utfördes för att demonstrera framgångsrik ligering av sonden på de virala kapsidproteinerna. Aha inkorporering visas att märka allt viruskapsidenproteiner (hexon, Penton och Fiber), medan O-GlcNAz inkorporering resulterar i märkning av Fiber bara.
I detta växande område, har flera metoder för azid-alkynen ligering kunnat utvecklas, men endast de två vi har funnit vara mest lämplig demonstreras här – stam-främjas azid-alkyn cykloaddition (SPAAC) och koppar-katalyserade azid-alkyn cykloaddition (CuAAC) under syrebefriad atmosfär.
Protocol
Discussion
Utvecklingen av kemoselektiv och bioorthogonal klicka reaktioner, däribland azider, är en snabbt växande forskningsområde, och därefter finns det ett växande antal av dessa reaktioner att välja mellan för biokonjugering applikationer. Vi har begränsat omfattningen av detta protokoll till att omfatta endast två metoder som valdes på grund av deras användbarhet i vårt eget labb och kommersiell tillgänglighet av alla reagenser.
I den första sträckan – stam-främjas azid-alkyn cy…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill erkänna NSF för finansiering (CBET-0.846.259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Riferimenti
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced “Clickable” Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimica. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
