Chemoselective تعديل السطوح الفيروسية عن طريق الكيمياء نقرة Bioorthogonal
Summary
صممت جزيئات الفيروس الغدي لاحتواء إما غير طبيعي التماثلية الأحماض الأمينية azidohomoalanine أو السكر azido<em> O</em>-GlcNAz. وligated chemoselectively المجموعة أزيد من كل ردود الفعل عن طريق "فوق" كيمياء كوسيلة لتعديل سطح الفيروسية.
Abstract
وقد تلقت لتعديل جزيئات الفيروس قدرا كبيرا من الاهتمام لإمكانياتها الهائلة في التأثير على العلاج الجيني، والتطبيقات oncolytic وتطوير لقاح. 1،2،3 النهج الحالية لتعديل أسطح الفيروسية، والتي هي في معظمها على أساس علم الوراثة، وغالبا ما تعاني من التوهين تنبيغ. 4،5 الإنتاج الفيروس، والعدوى والخلوية عن طريق chemoselective الكيمياء نقرة، قمنا بتطوير نهج بديل مباشر التي الالتفاف حول هذه القضايا على حد سواء في حين تبقى مرنة للغاية ويمكن الوصول إليها. 1،2
الهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على فعالية استخدام bioorthogonal كيمياء فوق لتعديل سطح من نوع اتش 5 الجسيمات. ويمكن استخدام هذه عملية من خطوتين سواء على المستوى العلاجي 1 أو تحليلي، 2،6 لأنها تسمح لربط chemoselective من الجزيئات التي تستهدف والأصباغ أو الجزيئات الأخرى ذات الاهتمام على البروتيناتمسبقا مع وصفت به أزيد. المزايا الثلاث الرئيسية لهذه الطريقة هي أن (1) وضع العلامات الأيضية يوضح شيئا يذكر لولا تأثير على اللياقة البدنية الفيروسية، 1،7 (2) يمكن أن تستخدم مجموعة واسعة من يغاندس المستجيب، و (3) فهي سريعة بشكل ملحوظ، وموثوق بها يسهل الوصول إليها. 1،2،7
في أول خطوة من هذا الإجراء، ويتم إنتاج جزيئات اتش تحمل إما azidohomoalanine (آها، مركب ميثيونين) أو السكر غير طبيعي O-N-مرتبط azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz)، وكلاهما والتي تحتوي على أزيد (N-3) وظيفية المجموعة. بعد تنقية للجزيئات الفيروس أزيد المعدلة، وligated تحقيقا آلكاين يحتوي على شاردة طمرة فلوري بطريقة chemoselective إلى البروتينات قبل المسمى أو بروتينات سكرية. أخيرا، يجري تحليل SDS-PAGE للتدليل على الربط الناجح للمسبار على البروتينات قفيصة الفيروسية. ويرد آها التأسيس لتسمية جميع قفيصة الفيروسيةالبروتينات (Hexon، بينتون والألياف)، في حين أن نتائج دمج O-GlcNAz في وضع العلامات من الألياف فقط.
في هذا المجال المتطور، وقد تم طرق متعددة لأزيد-آلكاين ربط نجحت في تطوير، ولكن فقط وهما أننا وجدنا أن يكون الأكثر ملاءمة وأثبت هنا – السلالة التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC) والنحاس والمحفز الاضافه الحلقيه أزيد-آلكاين (CuAAC) تحت جو امؤكسج.
Protocol
Discussion
تطور ردود الفعل فوق chemoselective وbioorthogonal، بما فيها تلك التي من أزيدات، هو منطقة التطور السريع للبحوث، وبعد ذلك هناك عدد متزايد من ردود الفعل هذه للاختيار من بينها لتقديم الطلبات bioconjugation. قيدت نحن في نطاق هذا البروتوكول لتشمل اثنين فقط من الأساليب التي تم اختيارها بسبب فا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف جبهة الخلاص الوطني للتمويل (CBET-0846259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Riferimenti
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced “Clickable” Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimica. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
