Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾
Summary
アデノウイルス粒子は、非天然アミノ酸類似体azidohomoalanineまたはアジド糖のいずれかを含むように設計されています<em> O</em>-GlcNAz。それぞれのアジド基は、化学選択的にウイルスの表面改質の手段として "クリック"化学反応を介して連結されています。
Abstract
ウイルス粒子の修飾は、遺伝子治療、腫瘍溶解性アプリケーションやワクチン開発に影響を与えるために、その途方もない可能性のために注目かなりの量のを受けています。主に遺伝学ベースでウイルスの表面を、変更することに1,2,3現在のアプローチは、しばしば減衰に苦しむウイルス産生の、感染性と細胞の情報伝達。4,5化学選択クリックケミストリーを使用して、我々は、柔軟性の高いアクセスの両方を維持しながら、これらの問題を回避し簡単な代替アプローチを開発しました。1,2
このプロトコルの目的は、アデノウイルス5型粒子の表面を変更するbioorthogonalクリックケミストリーを用いての有効性を実証することである。それは、タンパク質に標的分子、染料または関心のある他の分子の化学選択的ライゲーションすることができ、この2段階のプロセスは、両方の治療1または分析的に、2,6を使用することができますアジタグで事前標識。このメソッドの3つの主要な利点は、（1）代謝標識は、ウイルスフィットネスに影響を及ぼすことなく、1,7に少し例を示していること、（2）エフェクターリガンドの広い配列を利用することができる、（3）それが著しく、高速で信頼性の高いです。アクセスしやすい。1,2,7
この手順の最初のステップでは、アデノウイルス粒子がazidohomoalanine（AHA、メチオニンサロゲート）や不自然な糖アジド（-N 3）の機能が含まれ、どちらもO-結合N-azidoacetylglucosamine（O-GlcNAz）、のいずれかをベアリング製造されグループ。アジドで修飾されたウイルス粒子の精製後、蛍光TAMRA部分を含むアルキンプローブは、あらかじめ標識したタンパク質または糖タンパク質の化学選択的な方法で連結されています。最後に、SDS-PAGE分析は、ウイルスキャプシドタンパク質上のプローブのライゲーション成功を実証するために実行されます。 AHAの取り込みは、すべてのウイルスキャプシドにラベルを付けることが示されているタンパク質（ヘキソン、ペントンおよび光ファイバ）、唯一の繊維の標識O-GlcNAz取り込み結果中。
この進化分野では、アジド – アルキンライゲーションのために複数のメソッドが正常に開発されてきた。しかし、我々は最も便利であることが判明した2つだけがここに実証されて – ひずみ昇格アジド – アルキン環（SPAAC）と銅触媒によるアジド – アルキン環（CuAAC）脱酸素雰囲気下で。
Protocol
Discussion
アジドのものも含めて化学選択とbioorthogonalクリック反応の開発は、研究の急速に進化している領域であり、その後、バイオコンジュゲーションアプリケーションの中から選択するこれらの反応の増加があります。我々は、我々自身の研究室とすべての試薬の商業的利用であるため、その有用性から選ばれた唯一つの方法を含めるには、このプロトコルの範囲が制限されています。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、資金調達のためのNSF（CBET-0846259）を確認したいと思います。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Riferimenti
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