Chemoselective Модификация поверхности с помощью вирусного Bioorthogonal химии нажмите
Summary
Аденовирус частиц разработаны содержать либо неестественные аминокислоты azidohomoalanine аналог кислоты или азидо сахар<em> O</em>-GlcNAz. Азид группе каждый chemoselectively лигировали с помощью "мыши" химии реакции как средство вирусного модификации поверхности.
Abstract
Модификации вирусных частиц получило значительное внимание его огромный потенциал для воздействия генной терапии, онколитических приложений и разработки вакцины. 1,2,3 Современные подходы к изменению вирусной поверхности, которые в основном генетики основе, часто страдают от ослабления вируса производства, инфекционной и клеточной трансдукции. 4,5 Использование chemoselective химии клик, мы разработали простой альтернативный подход которое обходит эти вопросы, оставаясь при этом и очень гибкой и доступной. 1,2
Целью этого протокола является демонстрация эффективности использования bioorthogonal химии нажмите, чтобы изменить поверхность аденовируса типа 5 частиц. Это двухступенчатый процесс может быть использован как терапевтически 1 или аналитически, 2,6, поскольку оно позволяет chemoselective перевязки ориентации молекул, красителей или других молекул интереса на белкипредварительно помечены азид теги. Три главных преимущества этого метода в том, что (1) метаболический маркировки свидетельствует о практически не влияет на вирусную фитнес, 1,7 (2) широкий спектр эффекторных лигандами могут быть использованы, и (3), удивительно быстрый, надежный и легко получить доступ. 1,2,7
На первом этапе этой процедуры, аденовирус частицы рождаются либо несущих azidohomoalanine (Ага, метионин, суррогатная) или неестественной сахар O-связанных N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), оба из которых содержат азид (-N 3) функциональный группы. После очистки азида модифицированных вирусных частиц, алкин зонд содержащие флуоресцентные часть TAMRA лигируют в chemoselective образом, чтобы предварительно меченых белков и гликопротеинов. Наконец, SDS-PAGE анализ проводится для демонстрации успешного перевязки зонда на вирусные белки капсида. Ага включение показано на этикетке все вирусного капсидабелки (Hexon, Пентон и волокон), а О-GlcNAz включение результатов в маркировке волоконно только.
В этой развивающейся области, несколько методов для азид-алкин перевязки были успешно разработаны, однако только два мы обнаружили, что наиболее удобным демонстрируется здесь – деформации способствует азид-алкин циклоприсоединения (SPAAC) и медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) под венозная атмосферу.
Protocol
Discussion
Развитие chemoselective и нажмите bioorthogonal реакций, в том числе азиды, является быстро развивающейся областью исследований, а затем растет число этих реакций на выбор для bioconjugation приложений. Мы ограничили рамки этого протокола, чтобы включать только два метода, которые были выбраны из-за их пол…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы выразить благодарность NSF для финансирования (CBET-0846259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Riferimenti
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced “Clickable” Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimica. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
