Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal
Summary
Partículas de adenovirus se han diseñado para contener la natural azidohomoalanine análogo del ácido amino o el azúcar azida<em> O</em>-GlcNAz. El grupo azida de cada uno se quimioselectivamente ligó a través de reacciones químicas "clic" cuando un medio de modificación de la superficie vírica.
Abstract
La modificación de las partículas del virus ha recibido una cantidad significativa de la atención por su enorme potencial para impactar en la terapia génica, aplicaciones y desarrollo de vacunas oncolíticos. 1,2,3 Los enfoques actuales para la modificación de las superficies virales, que son en su mayoría basado en la genética, a menudo sufren de atenuación de producción de virus, la infectividad y celulares de transducción de 4,5. Uso de la química clic quimioselectiva, hemos desarrollado un método alternativo sencillo que deja de lado estos temas sin dejar de ser altamente flexible y accesible. 1,2
El objetivo de este protocolo es demostrar la efectividad del uso de la química clic bioorthogonal para modificar la superficie de adenovirus tipo 5 partículas. Este proceso de dos pasos puede ser utilizado tanto terapéuticamente 1 o analíticamente, 2,6, ya que permite la ligadura quimioselectiva de moléculas dirigidas, colorantes u otras moléculas de interés en las proteínaspre-etiquetados con etiquetas de azida. Las tres principales ventajas de este método son que (1) marcado metabólico demuestra poco o ningún impacto en la replicación viral, 1,7 (2) una amplia gama de ligandos efectores pueden ser utilizados, y (3) es muy rápido, fiable y de fácil acceso. 1,2,7
En el primer paso de este procedimiento, se producen partículas de adenovirus teniendo cualquiera azidohomoalanine (Aha, un sustituto metionina) o el azúcar no natural O-N-ligados azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos de los cuales contienen la azida (-N 3) funcional grupo. Después de la purificación de las partículas del virus azida modificados, una sonda fluorescente alquino que contiene el resto TAMRA se liga de manera quimioselectiva a las proteínas pre-etiquetados o glicoproteínas. Finalmente, un análisis de SDS-PAGE se realizó para demostrar la ligadura con éxito de la sonda sobre las proteínas de la cápside viral. Incorporación de Aha se muestra a etiquetar todos cápside viralproteínas (Hexon, Penton y fibra), mientras que O-GlcNAz resultados incorporación en el etiquetado de fibra óptica sólo.
En este campo en evolución, múltiples métodos para la ligadura de azida-alquino se han desarrollado con éxito, sin embargo, sólo los dos que hemos encontrado para ser más conveniente se ha demostrado en este documento – la cepa promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) y el cobre-catalizada cicloadición azida-alquino (CuAAC) bajo una atmósfera desoxigenada.
Protocol
Discussion
El desarrollo de las reacciones y haga clic en quimioselectiva bioorthogonal, incluidos los de azidas, es una zona de rápida evolución de la investigación, y, posteriormente, hay un creciente número de estas reacciones a elegir para aplicaciones bioconjugation. Hemos limitado el alcance de este protocolo para incluir sólo dos métodos que fueron escogidos debido a su utilidad en nuestro propio laboratorio y la disponibilidad comercial de todos los reactivos.
En la ruta tales primera – c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer la NSF para su financiación (CBET-0846259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Riferimenti
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