Kemoselektiv Modifikation af virale overflader via Bioorthogonal klik kemi
Summary
Adenoviruspartikler er manipuleret til at indeholde enten naturlig aminosyre analog azidohomoalanine eller azido sukker<em> O</em>-GlcNAz. Af azidgruppen af hver er kemoselektivt ligeret via "klik"-kemiske reaktioner som et middel til viral overflademodifikation.
Abstract
Ændringen af viruspartikler har modtaget en betydelig opmærksomhed for sit enorme potentiale for at påvirke genterapi, onkolytiske applikationer og udvikling af vacciner. 1,2,3 nuværende tilgange til at ændre virale overflader, som for det meste genetik-baserede, ofte lider af dæmpning af virus produktion, infektivitet og celletransduktion. 4,5 Brug kemoselektive klik kemi, har vi udviklet en simpel alternativ metode, som forbigås disse spørgsmål, mens de resterende både meget fleksibel og tilgængelig. 1,2
Målet med denne protokol er at demonstrere effektiviteten af at anvende bioorthogonal klik kemi at modificere overfladen af adenovirus type 5-partikler. Denne to-trins proces, kan anvendes både terapeutisk 1 eller analytisk, 2,6, da det tillader kemoselektiv ligering af målsøgningsmolekyler, farvestoffer eller andre molekyler af interesse på proteinerforudmærket med azid tags. De tre vigtigste fordele ved denne metode er, at (1) metabolisk mærkning viser ringe eller ingen indvirkning på vira, 1,7 (2) en bred vifte af effektor ligander kan anvendes, og (3) er det bemærkelsesværdigt hurtigt, pålideligt og nemt at få adgang. 1,2,7
I det første trin af denne procedure er adenoviruspartikler fremstilles under enten azidohomoalanine (Aha, en methionin surrogat) eller unaturlige sukker O-bundet N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), som begge indeholder azidet (-N3) funktionel gruppe. Efter oprensning af azid-modificerede viruspartikler er en alkyn probe indeholdende fluorescerende TAMRA del ligeres i en kemoselektiv måde til præ-mærkede proteiner eller glycoproteiner. Endelig er en SDS-PAGE-analyse udført for at demonstrere den vellykkede ligering af proben på de virale capsidproteiner. Aha inkorporering er vist at mærke alle virale capsidproteiner (Hexon, Penton og Fiber), mens O-GlcNAz inkorporering resulterer i mærkning af Fiber alene.
I denne udvikling område er flere metoder til azid-alkyn ligering med held blevet udviklet, men kun de to vi har fundet at være mest hensigtsmæssigt demonstreres heri – stamme-fremmet azid-alkyn cycloaddition (SPAAC) og kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC) under afiltet atmosfære.
Protocol
Discussion
Udviklingen af kemoselektive og bioorthogonal klik reaktioner, herunder azider, er en hastigt udviklende område af forskning, og efterfølgende er der et stigende antal af disse reaktioner for at vælge imellem for bioconjugation applikationer. Vi har begrænset rækkevidden af denne protokol til kun at omfatte to metoder, der blev valgt på grund af deres anvendelighed i vores eget laboratorium og kommercielle tilgængelighed af alle reagenser.
I den første vej – stamme-fremme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende NSF til finansiering (CBET-0.846.259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
Riferimenti
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced “Clickable” Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochimica. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
