Viral Sporing av genetisk Definert nevrale kretser
Summary
Fremgangsmåte for sporing synaptically tilkoblede nevroner er beskrevet. Vi bruker TVA spesifisitet av en oppstrøms cellen å sondere hvorvidt en cellepopulasjon av interesse får synaptiske innspill fra genetisk definerte celletyper.
Abstract
Klassiske metoder for å studere nevrale kretser er ganske lav gjennomstrømming. Transsynaptic virus, spesielt pseudorabies (PRV) og rabies virus (RABV), og mer nylig vesikulær stomatitt virus (VSV), for å studere kretser, blir stadig mer populært. Disse høyere gjennomstrømning metoder bruker virus som smitter mellom nerveceller i enten anterograd eller retrograd retning.
Nylig ble en modifisert RABV for monosynaptisk retrograd tracing utviklet. (Figur 1A). I denne metoden blir glykoprotein (G) genet slettet fra det virale genomet, og resupplied bare i målrettede nevroner. Infeksjon spesifisitet oppnås ved å substituere et kimært G, bestående av det ekstracellulære domenet til ASLV-A glykoprotein og den cytoplasmiske domenet av RABV-G (A / RG), for normal RABV-G 1. Dette chimeriske G infiserer spesifikt celler som uttrykker TVA reseptor 1. Genet som koder TVA kan vært delivered av ulike metoder 2-8. Etter RABV-G infeksjon i en TVA-uttrykke nervecellen, kan RABV overføre til andre, synaptically koblet nevroner i en retrograd retning av natur av sin egen G som var co-leveres med TVA reseptoren. Denne teknikken etiketter et relativt stort antall innganger (5-10%) 2 på en definert celletype, som gir en sampling av alle inngangene bort på en definert startbilde celletype.
Vi har nylig endret denne teknikken til å bruke VSV som transsynaptic tracer 9. VSV har flere fordeler, blant annet hurtighet av genuttrykk. Her har vi detalj en ny viral sporing ved hjelp VSV nyttig for sondering microcircuitry med økt oppløsning. Mens den opprinnelige publiserte strategier ved Wickersham et al. 4 og Beier et al. 9 tillatelse merking av eventuelle nevroner som prosjekt på først-smittet TVA-uttrykke-celler, her VSV ble utviklet for å overføre bare til TVA-uttrykke celler (figur 1b). Viruset er første pseudotyped med RABV-G for å tillate infeksjon av nevroner nedstrøms TVA-uttrykker nerveceller. Etter å infisere denne første populasjon av celler, utgitt viruset kan bare infisere TVA-uttrykke celler. Fordi transsynaptic viral spredning er begrenset til TVA-uttrykke celler, tilstedeværelse av fravær av tilkobling fra definerte celletyper kan utforskes med høy oppløsning. En eksperimentell flytdiagram av disse eksperimentene er vist i figur 2. Her viser vi en modell krets, at av retning-selektivitet i musen netthinnen. Vi undersøker tilkobling av stjerneglanseffekter amacrine celler (SACS) til retinal ganglion celler (RGCs).
Protocol
Discussion
Hjelp av virus å studere nevrale kretser er en relativt høy gjennomstrømning metode for å analysere tilkoblede nerveceller. Men, genererer både VSV og RABV virioner er ikke trivielt. Selv om protokollen ovenfor for å redde virus fra cDNA er gitt, er det fortsatt en lav sannsynlighet arrangementet. Nivåene av hver av N, P, og L plasmider må finjusteres, og mange forsøk og replikerer må gjøres for å sikre viral redning. Dannelsen av ribonukleotid partikkel omfatter en full VSV genom RNA er en lav-sannsynlighet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å erkjenne Sean Whelan for å få hjelp med å redde rekombinante VSV varianter, og Didem Goz og Ryan Chrenek for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av HHMI (CLC), og # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
Riferimenti
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
