Viral spåra genetiskt definierad neurala kretsar
Summary
En metod för att spåra synaptiskt anslutna nervceller beskrivs. Vi använder TVA specificitet en uppströms cell att söka om en cellpopulation av intresse får synaptisk input från genetiskt definierade celltyper.
Abstract
Klassiska metoder för att studera neuronala kretsar är ganska låg genomströmning. Transsynaptisk virus, i synnerhet pseudorabies (PRV) och rabies virus (RABV), och på senare vesikulär stomatit virus (VSV), för att studera kretsar, blir alltmer populärt. Dessa högre genomströmning metoder använder virus som sänder mellan nervceller i antingen anterograd eller retrograd riktning.
Nyligen har en modifierad RABV för monosynaptiska retrograd spårning utvecklats. (Figur 1A). I denna metod är glykoprotein (G)-genen bort från det virala genomet, och resupplied endast i riktade neuroner. Infektion specificitet uppnås genom att ersätta en chimär G, bestående av den extracellulära domänen av ASLV-Ett glykoprotein och den cytoplasmatiska domänen av RABV-G (A / RG), för den normala RABV-G 1. Denna chimära G infekterar specifikt celler som uttrycker TVA receptorn 1. Den gen som kodar TVA kan varit delivered genom olika metoder 2-8. Efter RABV-G infektion av en TVA-uttryckande neuron kan RABV överför till andra, synaptiskt anslutna nervceller i en retrograd riktning av naturen för sin egen G som var tillsammans levereras med TVA-receptorn. Denna teknik märker ett relativt stort antal ingångar (5-10%) 2 på en definierad celltyp, vilket ger ett urval av alla ingångar på en definierad förrätt celltyp.
Vi har ändrats nyligen denna teknik för att använda VSV som transsynaptisk spårämne 9. VSV har flera fördelar, däribland snabbheten av genuttryck. Här har vi detaljerat ett nytt viralt system för spårning med VSV användbart för sondering microcircuitry med ökad upplösning. Även om de ursprungliga publicerade strategier för Wickersham et al. 4 och Beier et al. 9 medger märkning av alla nervceller som projekt på initialt infekterade-TVA-uttryckande-celler, här VSV var konstruerad för att överföra endast till TVA-uttryckande celler (figur 1B). Viruset först pseudotypade med RABV-G för att tillåta infektion av nervceller nedströms TVA-uttryckande neuroner. Efter infektera denna första population av celler, släpptes viruset kan bara infektera TVA-uttryckande celler. Eftersom transsynaptisk viral spridning är begränsad till TVA-uttryckande celler, närvaro eller frånvaro av anslutning från definierade celltyper kan utforskas med hög upplösning. En experimentell flödesschema av dessa experiment visas i figur 2. Här visar vi en modell krets som inriktning, selektivitet i mus näthinnan. Vi undersöker uppkopplingen av starburst amacrine celler (SAC) till näthinneganglieceller (RGC).
Protocol
Discussion
Använda virus att studera neurala kretsar är en relativt hög genomströmning för analys anslutna neuroner. Men generera både VSV och RABV virioner är inte trivialt. Även om protokollet ovan för att rädda virus från cDNA som är det fortfarande en låg sannolikhet händelse. Nivåerna av var och en av N, P och plasmider L måste finjusteras, och många försök och replikerar behöver göras för att säkerställa viral räddning. Bildandet av ribonukleotiden partikeln innefattar en fullständig VSV-genomet RNA…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka för Sean Whelan för hjälp med att rädda rekombinant VSV varianter och Didem Goz och Ryan Chrenek för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av HHMI (CLC) och # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
Riferimenti
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
