Bruk av LysoTracker å oppdage programmert celledød i Embryoer og Skille Embryonic Stem Cells

Summary

Vi presenterer en enkel protokoll å visualisere regioner av programmert celledød (PCD) i mus embryoer og differensierende embryonale stamceller (ES) cellekulturer ved hjelp av en svært løselig fargestoff kalt LysoTracker.

Abstract

Programmert celledød (PCD) oppstår hos voksne til å opprettholde normal vev homeostase og under embryologiske utvikling for å forme vev og organer ^1,2,6,7. Under utviklingen kan giftige kjemikalier eller genetiske endringer føre til en økning i PCD eller endre PCD mønstre som resulterer i utviklingsavvik og fødselsskader ^3-5. For å forstå etiologien av disse defektene kan utredningen av embryoene suppleres med di vitro analyser som bruker differensierende embryonale stamceller (ES) celler.

Apoptose er en godt studert form av PCD som involverer både indre og ytre signalering for å aktivere caspase enzymet kaskade. Karakteristiske celleforandringer inkluderer membran blebbing, kjernekraft krymper, og DNA-fragmentering. Andre former for PCD ikke involverer caspase aktivering og kan være slutten-resultat av langvarig autophagy. Uavhengig av PCD sti, døende celler må fjernes. Hos voksne, immunceller perfOrm denne funksjon, mens i embryoer, hvor immunsystemet ennå ikke har utviklet, oppstår fjerning ved en alternativ mekanisme. Denne mekanismen innebærer nabocellene (kalt "ikke-profesjonelle fagocytter") tar på en phagocytic rolle-de anerkjenner "spise meg" signal på overflaten av den døende celle og sluker det ^8-10. Etter engulfment blir rusk brakt til lysosomer for degradering. Således uavhengig av PCD mekanisme, kan en økning i lysosomal aktiviteten bli korrelert med økt celledød.

Å studere PCD, en enkel analyse for å visualisere lysosomer i tykke vev og flerlags differensierende kulturer kan være nyttig. LysoTracker fargestoff er et svært løselig lite molekyl som er beholdt i sure subcellulære avdelinger som lysosomer ^11-13. Fargestoffet er tatt opp ved diffusjon og gjennom sirkulasjonen. Siden penetrasjon er ikke en hindring, visualisering av PCD i tykke vev og multi-layer kulturer er mulig ^12,13 </sup>. I kontrast er tunel (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick slutten merking) analyse ^14, begrenset til små prøver, histologiske seksjoner, og monolagskulturer fordi prosedyren krever inntasting / permeabilitet av en terminal transferase.

I motsetning til Aniline blått, som diffunderer og er oppløst av løsemidler, er LysoTracker Red DND-99 fixable, lyse og stabil. Farging kan visualiseres med standard fluorescerende eller konfokalmikroskopi i hel-mount eller seksjon med vandig eller løsemiddel-baserte montering media ^12,13. Her beskriver vi protokoller som bruker denne fargen å se på PCD i normal og sonic hedgehog null mus embryoer. I tillegg viser vi analyse av PCD i differensiere ES cellekulturer og presentere en enkel kvantifisering metode. Oppsummert kan LysoTracker flekker være et flott supplement til andre metoder for å oppdage PCD.

Protocol

1. LysoTracker Farging av mus embryo Generere mus embryoer ved å plassere unge (5-6 uker gamle) kvinner i mannlige stud bur. Skjerm på følgende morgen for utseendet av en vaginal plugg indikerer at parring har oppstått. Hvis kvinnen er gravid, er middag på den dagen som heter 0.5 DPC (dager etter samleie). Prosedyren som presenteres her er ideelt for embryo 7-13 DPC. På den embryonale dag av interesse, avlive den kvinnelige henhold til godkjente protokoller og fjerne livmoren. Fjerne fostre fr…

Discussion

Viktige kjennemerkene apoptose inkluderer påvisning av DNA-skade med Tunel analysen sammen med påvisning av kaspase-aktivitet (påvist med mAbs eller bindingsmolekyl som ZVAD-FMK), observasjon av cellulære endringer, og presentasjonen av fosfatidylserin (PS ) på membranoverflaten (detektert av Annexin V binding). Det er noen ulemper med hver av disse analysene. For eksempel gjelder terminalen transferase brukt i tunel analysen ikke trenge utover noen få cellelagene. Også Annexin V kan markere celler som ikke gjenn…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl