Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Summary

Kristallstruktur von Protein-DNA-Komplexe können Einblick in Proteinfunktion, Mechanismus, sowie, die Natur der spezifischen Wechselwirkung bereitzustellen. Hier berichten wir, wie die Länge, Sequenz und Enden der DNA-Doppelstrang für Co-Kristallisation zu optimieren mit<em> Escherichia coli</em> SeqA, ein negativer Regulator der Replikation Initiation.

Abstract

Escherichia coli SeqA ist ein negativer Regulator der DNA-Replikation, die vorzeitige Reinitiation Ereignisse durch Maskierungsmittel hemimethylierte GATC Cluster verhindert innerhalb der Replikationsursprung ^ein. Jenseits der Herkunft, wird SeqA an den Replikationsgabeln, wo es neu replizierte DNA organisiert in höhere geordneten Strukturen ² gefunden. SeqA Mitarbeiter nur schwach mit einzelnen GATC-Sequenzen, aber es bildet eine hohe Affinität Komplexe mit DNA-Duplexe mit mehreren GATC Seiten. Die minimale funktionelle und strukturelle Einheit SeqA ein Dimer, wodurch Erläuterung der Anforderung von wenigstens zwei GATC-Sequenzen, um eine hohe Affinität Komplex mit DNA hemimethylierte ^{3 zu} bilden. Zusätzlich erlaubt die SeqA Architektur, mit der Oligomerisierung und DNA-bindenden Domänen durch einen flexiblen Linker getrennt sind, die Bindung an GATC Repeats durch bis zu drei Wendelgänge getrennt. Daher Verständnis der Funktion SeqA auf molekularer Ebene erfordert die strukturelle anaLyse SeqA mehrere GATC Sequenzen gebunden. In Protein-DNA Kristallisation kann DNA keine haben eine außergewöhnliche Wirkung auf die Verpackung Wechselwirkungen in Abhängigkeit von den relativen Größen und Architektur des Proteins und der DNA. Wenn das Protein größer ist als die DNA oder Fußabdrücke meisten der DNA wird die Kristallpackung primär durch Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt. Umgekehrt, wenn das Protein die gleiche Größe oder kleiner als der DNA ist, oder es deckt nur einen Teil der DNA-, DNA-DNA-und DNA-Protein-Wechselwirkungen Kristallpackung dominieren. Daher erfordert Kristallisation von Protein-DNA-Komplexe die systematische Screening von DNA-Länge ⁴ und DNA-Enden (blunt oder Überhang) ^5-7. In diesem Bericht beschreiben wir, wie zu entwerfen, zu optimieren, zu reinigen und zu kristallisieren hemimethylierte DNA-Duplexe mit Tandem-GATC Wiederholungen im Komplex mit einem dimeren Variante SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), um geeignete Kristalle für die Strukturaufklärung erhalten.

Protocol

Ein. Protein Purification Der flexible Linker, das N-(Oligomerisierung) und C-terminalen (DNA Bindung) Domänen von SeqA Hilfsmittel die Erkennung hemimethylierte GATC Repeats durch ein bis drei Windungen auf der DNA getrennt. Für diese Studie verwendeten wir eine dimere Variante SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) mit einer Punktmutation in der N-terminalen Domäne, die weitere Oligomerisierung und eine verkürzte DNA Linkers, der die Bindung an GATC Tandem wiederholt ausschließlich durch abgetrennt…

Discussion

Eine der größten Herausforderungen in der makromolekularen Röntgenkristallographie ist der Erhalt Beugungsqualität Kristalle. Im Falle von Protein-oder Protein-DNA-Komplexe, wird diese Herausforderung verschärft durch die zusätzlichen Variablen optimiert werden müssen. Es wird allgemein angenommen, dass die Länge der DNA und die Anwesenheit von klebrigen Überhänge zur Vereinigung von benachbarten DNA-Moleküle in einer längeren Pseudo-Duplex werden die wesentlichen Parameter zur Optimierung verbessern. Wir ha…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments (optional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.