SeqA-DNA複合体の結晶化のためのDNA二重鎖の反復最適化
Summary
タンパク質-DNA複合体の結晶構造は、タンパク質の機能、機構、ならびに、特定の相互作用の性質についての洞察を提供することができます。ここでは、との共結晶の長さ、配列および二本鎖DNAの末端を最適化する方法を報告して<em>大腸菌</em> SeqA、複製開始の負の調節因子。
Abstract
大腸菌 SeqAは複製1の原点内封鎖ヘミメチルGATCクラスターによる早期再開始イベントを防ぐDNA複製の負の調節因子である。原点を超えて、SeqAは複製フォーク、それがより高い秩序構造に新しく複製されたDNAを整理2で見出される。 SeqAシングルGATC配列と共に弱くしか仲間が、それは複数GATC部位を含むDNA二重鎖と親和性の高い複合体を形成している。 SeqAの最小限の機能と構造単位は、それによってヘミメチル化DNA 3と高親和性複合体を形成するために少なくとも2つのGATCシーケンスの要件を説明し、二量体である。さらに、SeqAアーキテクチャは、オリゴマー化と柔軟なリンカーによって分離されたDNA結合ドメインと、3つの螺旋回転までで区切らGATCリピートに結合することができます。したがって、分子レベルでSeqAの機能を理解することは構造的アナログを必要と複数GATC配列に結合SeqAの溶解。タンパク質-DNAの結晶化では、DNAはタンパク質とDNAの相対サイズとアーキテクチャに応じてパッキング相互作用に非常に優れた効果をnoneに持つことはできません。タンパク質はDNAまたはDNAの足跡のほとんどよりも大きい場合には、結晶充填は、主に、タンパク質 – タンパク質相互作用によって媒介される。逆に、タンパク質はDNAよりも同じサイズ以下であるか、またはそれが唯一のDNA、DNA-DNAとDNA-タンパク質相互作用の一部をカバーするとき、結晶パッキングを支配している。したがって、タンパク質-DNA複合体の結晶化は、DNAの長さ4、DNA末端（鈍またはオーバーハング）5-7の体系的スクリーニングを必要とします。本稿では、設計、最適化、精製および構造決定に適した結晶を得ることがSeqAの二量体変異体（SeqAΔ（41から59）-A25R）と複合したタンデムGATCリピートを含むヘミメチル化DNA二重鎖を結晶化する方法について説明します。
Protocol
Discussion
高分子のX線結晶学における最大の課題の1つは、回折品質の結晶を得ることである。タンパク質またはタンパク質-DNA複合体の場合には、このチャレンジが最適化されなければならない追加の変数が原因で悪化している。それは広く利用されているDNAの長さと粘り気のオーバーハングの存在は長く擬似二重に隣接するDNA分子の関連付けを強化すると考えられている最適化するための主要なパラ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、DNA精製のヘルプについては、データ収集とモニカPillon時の援助のためのNSLS（ブルックヘブン国立研究所）でPXRRのスタッフに感謝したいと思います。この作品は、カナダ衛生研究所（MOP 67189）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
Riferimenti
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