SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복
Summary
단백질 DNA 단지의 결정 구조는 단백질 기능, 메커니즘뿐만 아니라, 특정 상호 작용의 성격에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기, 우리는 함께 공동 결정의 길이, 순서 및 이중 DNA의 끝을 최적화하는 방법을보고<em> 대장균</em> SeqA, 복제 개시의 네거티브 레귤레이터.
Abstract
에스 케리 키아 대장균 SeqA 복제 1의 기원에서 sequestering hemimethylated GATC 클러스터의 조기 reinitiation 이벤트를 방지 DNA 복제의 부정적인 레귤레이터입니다. 원산지 외에도 SeqA은 복제 포크, 그것이 높은 명령 구조로 새로 복제 된 DNA를 구성 2 발견됩니다. SeqA 동료는 약하게 하나의 GATC 시퀀스로하지만, 여러 GATC 사이트를 포함하는 DNA의 duplexes 높은 친화 단지를 형성한다. SeqA의 최소한의 기능 및 구조 단위는이를 hemimethylated DNA 3 고친 화성 단지를 형성하는 적어도 두 개의 GATC 시퀀스의 요구 사항을 설명하고, 이량 체입니다. 또한, oligomerization과 유연한 링커로 구분하여 DNA 결합 도메인 SeqA 아키텍처, 3 나선형 회전까지로 구분 GATC 반복에 바인딩 할 수 있습니다. 따라서, 분자 수준에서 SeqA의 기능을 이해하는 것은 구조적 아나가 필요합니다SeqA의 용해는 여러 GATC 시퀀스에 바인딩. 단백질 DNA의 결정에서 DNA는 단백질과 DNA의 상대적인 크기와 건축에 따라 포장의 상호 작용에 탁월한 효과 하나도 없다. 단백질은 DNA 나 발자국 DNA의 대부분을보다 큰 경우, 크리스탈 포장은 주로 단백질 단백질 상호 작용에 의해 중재됩니다. 반대로, 단백질이 DNA보다 같은 크기 또는 작은 또는 만 DNA, DNA-DNA 및 DNA-단백질 상호 작용의 일부를 포함 할 때 크리스탈 포장을 지배. 따라서, 단백질 DNA 단지의 결정은 DNA의 길이 4 DNA 종료 (둔기 나 오버행) 5-7의 체계적인 심사가 필요합니다. 이 보고서에서, 우리는 설계, 최적화, 정화 및 구조 결정에 적합한 결정을 얻을 수 SeqA의 dimeric 변형 (SeqAΔ (41-59) – A25R)으로 단지에 나란히 GATC 반복을 포함 hemimethylated의 DNA duplexes을 결정화하는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
Discussion
macromolecular X-선 결정학에서 가장 큰 도전 중 하나는 회절 품질 결정을 획득하고 있습니다. 단백질 또는 단백질 DNA 단지의 경우,이 도전은 최적화되어야합니다 추가 변수로 인해 악화됩니다. 그것은 널리 DNA의 길이와 끈적 overhangs의 존재가 더 이상 가상 이중의 주요 매개 변수를 최적화하는 것입니다에 인접한 DNA 분자의 연결을 강화하기 졌다고합니다. 그러나, 우리는 이러한 overhangs의 특성과 길?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 DNA 정화와 관련하여 도움이 데이터 수집 및 모니카 Pillon 동안 도움을 NSLS (브룩 헤이븐 국립 연구소)에서 PXRR 직원을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 67189)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
Riferimenti
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