Iterativ Optimalisering av DNA Duplex for krystallisering av SeqA-DNA komplekser

Summary

Krystallstruktur av protein-DNA komplekser kan gi innsikt i protein funksjon, mekanisme, samt, arten av den spesifikke interaksjon. Her rapporterer vi hvordan du kan optimalisere lengden, rekkefølge og ender dupleks DNA for co-krystallisering med<em> Escherichia coli</em> SeqA, en negativ regulator av replikering innvielse.

Abstract

Escherichia coli SeqA er en negativ regulator av DNA replikasjon som hindrer for tidlig reinitiation hendelser etter avsondringsmidler hemimethylated GATC klynger innenfor replikasjonsorigo ^en. Utover opprinnelse, er SeqA funnet på replikering gafler, hvor den organiserer nylig kopiert DNA i høyere beordret strukturer ^to. SeqA knytter bare svakt med enkle GATC sekvenser, men den danner høy affinitet komplekser med DNA duplexes inneholder flere GATC nettsteder. Minimal funksjonell og strukturell enhet av SeqA er en dimer, og dermed forklarer kravet om minst to GATC sekvenser for å danne en høyaffinitets-kompleks med hemimethylated DNA ^3. I tillegg tillater SeqA arkitekturen med oligomerisering og DNA-bindende domener som er atskilt med en fleksibel linker, binding til GATC gjentar atskilt av opptil tre skrueformede omdreininger. Derfor å forstå funksjonen av SeqA på et molekylært nivå krever strukturelle analysis av SeqA bundet til flere GATC sekvenser. I protein-DNA krystallisering, kan DNA ha ingen til en eksepsjonell effekt på pakking interaksjoner avhengig av den relative størrelse og arkitektur av proteinet og DNA. Hvis proteinet er større enn DNA eller overføringene fleste av DNA, blir krystall pakking hovedsak mediert av protein-protein interaksjoner. Omvendt, når proteinet er av samme størrelse eller mindre enn DNA eller den bare dekker en brøkdel av de DNA, DNA-DNA og DNA-protein interaksjoner dominerer krystall pakking. Derfor krever krystallisering av protein-DNA komplekser systematisk screening av DNA lengde ⁴ og DNA ender (sløv eller overheng) ^5-7. I denne rapporten beskriver vi hvordan å designe, optimalisere, rense og krystallisere hemimethylated DNA duplexes inneholder tandem GATC gjentar i komplekset med en dimerglycerol variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) for å få krystaller egnet for strukturbestemmelse.

Protocol

1. Proteinrensing Den fleksible linker kobler N-(oligomerisering) og C-terminale (DNA-binding) domener av SeqA hjelpemidler anerkjennelse av hemimethylated GATC gjentar separert med 1-3 omdreininger på DNA. For denne studien brukte vi en dimerglycerol variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) med en punktmutasjon i det N-terminale domenet som forhindrer ytterligere oligomerisering og en forkortet linker som begrenser DNA-binding til tandem GATC gjentar separert eksklusivt av en omdreining på DNA…

Discussion

En av de største utfordringene i macromolecular røntgenkrystallografi er å skaffe diffraksjon kvalitet krystaller. I tilfelle av protein eller protein-DNA komplekser, er denne utfordringen forverret på grunn av de ytterligere variabler som må optimaliseres. Det er antatt at lengden av DNA og tilstedeværelsen av klebrige overheng for å forbedre sammenslutning av nabo DNA molekyler i en lengre pseudo-dupleks er de viktigste parametre for å optimalisere. Imidlertid, har vi vist at naturen og lengden av disse overhe…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments (optional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.