Итерационные Оптимизация дуплексов ДНК для кристаллизации SeqA ДНК-комплексов

Summary

Кристаллическая структура белка-ДНК может дать представление о функции белка, механизма, а также, характера конкретного взаимодействия. Здесь мы сообщаем о том, как оптимизировать длину, последовательность и концы ДНК-дуплекса для совместной кристаллизации с<em> Кишечной палочки</em> SeqA, негативный регулятор инициации репликации.

Abstract

Кишечная палочка SeqA является негативным регулятором репликации ДНК, что предотвращает преждевременное возобновление событий изолирующих hemimethylated GATC кластеров в начало репликации ^1. Помимо происхождения, SeqA находится на репликацию вилки, где он организует новореплицированные ДНК в более упорядоченной структуры ^2. SeqA ассоциируется только с одним слабо GATC последовательностей, но он образует комплексы высокого сходства с ДНК-дуплексов, содержащих несколько GATC сайтов. Минимальные функциональные и структурные единицы SeqA представляет собой димер, тем самым объясняя требование по крайней мере два GATC последовательности, чтобы сформировать высоким сродством комплексе с ДНК hemimethylated ^3. Кроме того, архитектура SeqA, с олигомеризации и ДНК-связывающих доменов, разделенных гибкий линкер, позволяющий привязки к GATC повторов, разделенных до трех винтовых поворотов. Таким образом, понимание функции SeqA на молекулярном уровне требует структурного Anaлизис SeqA связан с несколькими GATC последовательности. В белок-ДНК кристаллизации, ДНК может иметь никто не исключительный эффект на упаковке взаимодействий в зависимости от относительных размеров и архитектуры белков и ДНК. Если белка больше, чем ДНК или отпечатки большая часть ДНК, кристаллической упаковки в первую очередь опосредовано белок-белковых взаимодействий. И наоборот, когда белка такое же или меньшего размера, чем ДНК или она покрывает лишь часть ДНК, ДНК-ДНК и ДНК-белковых взаимодействий доминировать кристаллической упаковки. Таким образом, кристаллизация белок-ДНК комплексов требует систематического скрининга ДНК ⁴ длины и ДНК концами (тупым или навес) ^5-7. В этом докладе мы опишем, как разрабатывать, оптимизировать, очистить и кристаллизуются hemimethylated дуплексов ДНК, содержащий тандем GATC повторяется в комплексе с димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), чтобы получить кристаллы подходят для определения структуры.

Protocol

1. Очистки белков Гибкий линкер подключения N-(олигомеризации) и C-терминал (связывание ДНК) областях SeqA средствами признание hemimethylated GATC повторяет отделена от одного до трех поворотов на ДНК. Для этого исследования мы использовали димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) с точечной…

Discussion

Одна из самых больших проблем в макромолекулярных рентгеновской кристаллографии является получение кристаллов дифракция качества. В случае белок или белок-ДНК комплексов, эта задача осложняется из-за дополнительных переменных, которые должны быть оптимизированы. Широко распростран…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments (optional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.