Iterativo de optimización de dúplex de ADN para la cristalización de SEQA-ADN complejos

Summary

Estructura cristalina de los complejos de proteínas de ADN puede proporcionar información sobre la función de proteínas, el mecanismo, así como, la naturaleza de la interacción específica. Aquí reportamos cómo optimizar la longitud, la secuencia y los extremos del ADN dúplex en co-cristalización con<em> Escherichia coli</em> SEQA, un regulador negativo de la iniciación de la replicación.

Abstract

Escherichia coli SEQA es un regulador negativo de la replicación del ADN que impide prematuros eventos reiniciación por secuestrantes GATC grupos hemimethylated dentro del origen de replicación ^1. Más allá del origen, SEQA se encuentra en las horquillas de replicación, donde se organiza ADN recién replicado en mayores estructuras ordenadas ^2. Asociados SEQA sólo débilmente con las secuencias GATC individuales, sino que forma complejos de alta afinidad con dúplex de ADN que contienen múltiples sitios GATC. La unidad mínima funcional y estructural de SEQA es un dímero, lo que explica el requisito de al menos dos secuencias GATC para formar un complejo de alta afinidad con el ADN hemimethylated ^3. Además, la arquitectura SEQA, con la oligomerización y dominios de unión al ADN separados por un enlazador flexible, permite la unión a repeticiones GATC separados por hasta tres vueltas helicoidales. Por lo tanto, la comprensión de la función de SEQA a nivel molecular estructural requiere la analisis de SEQA unido a múltiples secuencias GATC. En la cristalización de proteínas-ADN, el ADN puede tener ninguno a un efecto excepcional en las interacciones de embalaje en función de los tamaños relativos y la arquitectura de la proteína y el ADN. Si la proteína es más grande que el ADN o huellas de la mayoría del ADN, el cristal de embalaje es principalmente mediada por interacciones proteína-proteína. A la inversa, cuando la proteína es del mismo tamaño o más pequeño que el ADN o sólo cubre una fracción de las interacciones ADN, ADN-ADN y ADN-proteína dominar cristal de embalaje. Por lo tanto, la cristalización de proteínas de ADN complejos requiere el cribado sistemático de ADN de longitud y ⁴ extremos de ADN (romo o saliente) ^5-7. En este reporte se describe cómo diseñar, optimizar, purificar y cristalizar hemimethylated dúplex de ADN que contienen repeticiones en tándem GATC en el complejo con una variante dimérica de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) para obtener cristales adecuados para la determinación de la estructura.

Protocol

1. Purificación de proteínas El enlazador flexible que une el. N-(oligomerización) y C-terminal (de unión a ADN) dominios de SEQA SIDA el reconocimiento de hemimethylated repite GATC separados por uno a tres vueltas en el ADN Para este estudio, se utilizó una variante dimérica de SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) con una mutación puntual en el dominio N-terminal que impide aún más la oligomerización y un enlazador acortado que restringe la unión al ADN en tándem para GATC repite separados…

Discussion

Uno de los mayores retos en macromolecular cristalografía de rayos X es la obtención de cristales de difracción de calidad. En el caso de complejos de proteínas o ADN-proteína, este reto se agrava debido a las variables adicionales que deben ser optimizados. Se cree ampliamente que la longitud del ADN y la presencia de voladizos pegajosas para mejorar la asociación de moléculas de ADN vecinos en un tiempo pseudo-duplex son los principales parámetros a optimizar. Sin embargo, hemos demostrado que la naturaleza y …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments (optional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.