Ingegneria tessuti muscolo scheletrico di cellule murine progenitrici mioblasti e di applicazione di stimolazione elettrica

Summary

Tessuto muscolare Engineered ha un grande potenziale nel campo della medicina rigenerativa, come modello di malattia e anche come una fonte alternativa per la carne. Qui si descrive la progettazione di un costrutto muscolare, in questo caso da cellule progenitrici mioblasti di topo, e la stimolazione da impulsi elettrici.

Abstract

Tessuti muscolari ingegnerizzati possono essere utilizzati per diversi scopi, tra cui la produzione di tessuti per l'uso come un modello di malattia in vitro, ad esempio uno studio ulcere da decubito, per la medicina rigenerativa e come alternativa carne ^1. I primi costrutti riportati muscolari 3D sono stati fatti molti anni fa e pionieri nel campo sono Vandenburgh ^2,3 e colleghi. I progressi realizzati in ingegneria del tessuto muscolare non sono solo il risultato della plusvalenza vasta delle conoscenze sui fattori biochimici, cellule staminali e cellule progenitrici, ma sono basati in particolare sulle conoscenze acquisite dai ricercatori che i fattori fisici giocano un ruolo essenziale nel controllo del comportamento delle cellule e tessuti sviluppo. State-of-the-art muscolo ingegneria costruisce attualmente sono costituiti da cellule popolate costrutti idrogel. Nel nostro laboratorio questi in genere sono costituiti da cellule murine progenitrici, mioblasti murini isolati da muscoli degli arti posteriori o una linea cellulare murina mioblasti C2C12, missati con una miscela di collagene / Matrigel e piastrate tra due punti di ancoraggio, imitando i legamenti muscolari. Altre cellule possono essere considerati anche, ad esempio linee cellulari alternativi come mioblasti di ratto L6 ^4, neonatali cellule progenitrici muscolari derivate ^5, le cellule derivate da tessuti muscolari adulti di altre specie come ⁶ umana o anche cellule staminali pluripotenti indotte (cellule iPS) ⁷ . Contrattilità cellula causa l'allineamento delle cellule lungo l'asse del costrutto ^8,9 e differenziazione delle cellule progenitrici muscolari dopo circa una settimana di cultura. Inoltre, l'applicazione di stimolazione elettrica può migliorare il processo di differenziazione in qualche misura ^8. A causa della sua dimensione limitata (8 x 2 x 0,5 mm) del tessuto completo possono essere analizzati mediante microscopia confocale per monitorare redditività esempio, la differenziazione cellulare e allineamento. A seconda dell'applicazione specifica i requisiti per l'engineetessuto muscolare rosso varierà; uso ad esempio per la medicina rigenerativa richiede l'aumento progressivo delle dimensioni e la vascolarizzazione del tessuto, mentre per servire come traduzione alternativa carne da altre specie è necessaria.

Protocol

1. Coltura di cellule progenitrici dei mioblasti murini C2C12 o cellule

1. Isolare cellule secondo il protocollo inizialmente pubblicato da Shefer e colleghi ¹⁰ e successivamente adattato da Collins et al. ¹¹ e Boonen et al. ¹² e memorizzare questi in azoto liquido. Questo richiede topi, per esempio C57Bl / 6. Metodi alternativi sono utilizzati in altri laboratori, ad esempio un metodo pubblicato in Journal of Experiments visualizzati da Li Y et al. ^13. Per i reagenti e le attrezzature si rimanda alla tabella a pagina 7 e 8. Dal muscolo da un mouse è in genere sufficiente....

Results

Il prodotto finale sarà costrutti muscolari, come indicato in Figura 3. La dimensione del tessuto sarà di circa 8 mm, 2 mm di larghezza e 0,5 mm di spessore. Stimolazione elettrica durante la differenziazione cambierà l'espressione di isoforme della catena pesante della miosina, ma non di migliorare notevolmente il processo di differenziazione indotta dal terreno di differenziamento 8, ma stimolazione elettrica può essere applicata anche al termine del processo per controllare la funzionalità del muscol.......

Discussion

L'ingegneria dei tessuti muscolari ha un grande potenziale per l'uso come un modello di malattia, per lo screening di stupefacenti, nella medicina rigenerativa e per la produzione di carne. Tuttavia, i requisiti per queste applicazioni variano. Abbiamo scelto di lavorare con una combinazione di collagene e matrigel, collagene perché permette l'allineamento cellulare e perchè i mioblasti progenitrici richiedono la presenza di proteine ​​della membrana basale derivate come determinato in studi precedenti 2D

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Matrigel-fattore di crescita ridotta	Beckton Dickinson e
DMEM (glucosio) *	Gibco	42430
Avanzata DMEM	Gibco	12491
Siero di cavallo	Gibco	65050-122
Siero fetale bovino	Greiner	758075
0,45 e 0,22 micron siringa filtro *	Whatmann (Schleicher e Scheull)	10462100
L-glutammina	Gibco	25030024
Penicillina / streptomicina	Gibco	10378016
Amfotericina	Gibco	15290-018
Cultura plastica	Greiner		Include beute di coltura e delle pipette
Chick embrione estratto	Stati Uniti biologica	C3999
Pipetta Pasteur *	Hilgenberg		Pipette Pasteur, con la costrizione, con cotone, L aperta punta: 230 mm con diametro di punta di 0,9 - 1,1 mm
Pipetta Pasteur *	Hilgenberg		Pipette Pasteur, con la costrizione, con cotone, L aperta punta: 230 mm con diametro di punta di 1,4 - 1,6 mm
Pipetta Pasteur	VWR	612-1702
Collagenasi tipo I*	Sigma	C0130-16
40 celle filtro micron *	BD Falcon	352340
Ago 19G
Elastomero	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210 #
Agente indurente	Dow Corning Corporation		Silastic MDX 4-4210 #
Velcro	Negozio di regolare		È possibile acquistare questo in un negozio normale, utilizzare solo il lato morbido
Il collagene di tipo I, coda di topo	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP Cultura Pacer	Ionoptix
6 pozzetti piastre di coltura per la stimolazione elettrica	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon # 353846
C-Dish cultura piatto elettrodi	Ionoptix
			* È necessario per l'isolamento di cellule (punto 1.1) # Insieme in un unico kit