Undersökning av thymus Positiv och negativ selektion genom flödescytometri
Summary
Vi presenterar ett flödescytometri-baserad metod för att undersöka T-cell-utveckling<em> In vivo</em> Använda genetiskt manipulerade möss på en vildtyp eller T-cell receptor transgena bakgrund.
Abstract
Ett friskt immunsystem kräver att T-celler svarar på främmande antigener samtidigt som den är tolerant mot själv-antigener. Slumpvis omlagring av T-cell receptorn (TCR) α och β loci genererar en T-cell repertoar med stor mångfald i antigenspecificitet, både för sig själv och utländska. Val av repertoaren under utveckling i tymus är kritisk för att generera säkra och användbara T-celler. Defekter i tymus val bidra till utvecklingen av autoimmuna och immunbristsjukdomar 1-4.
T-cell stamfäder in tymus som dubbla negativa (DN) tymocyter som inte uttrycker CD4 eller CD8 co-receptorer. Redovisning av αβTCR och båda co-receptorer sker vid dubbla positiva (DP) steg. Interaktion av αβTCR med själv-peptid-MHC (pMHC) presenteras av tymusceller bestämmer ödet för DP tymocyt. Hög affinitet interaktioner leder till negativ selektion och elimineringning av självreaktiva tymocyter. Låg affinitet interaktioner resulterar i positiv selektion och utveckling av CD4 eller CD8 enda positiv (SP) T-celler kan känna igen främmande antigener presenteras av själv-MHC 5.
Positiv selektion kan studeras i möss med en polyklonal (vildtyp) TCR repertoar genom att observera alstring av mogna T-celler. Emellertid, är de inte ideala för studier av negativ selektion, som involverar deletion av små antigenspecifika populationer. Många modellsystem har använts för att studera negativ selektion men varierar i sin förmåga att rekapitulera fysiologiska händelser 6. Till exempel, in vitro-stimulering av tymocyter saknar tymus miljö som är intimt inblandad i valet, medan administrering av exogent antigen kan leda till icke-specifik deletion av tymocyter 7-9. För närvarande är de bästa verktygen för att studera in vivo negativ selektering är möss som uttrycker en transgENIC TCR specifik för endogen själv-antigen. Men många klassiska TCR transgena modeller som kännetecknas av tidig expression av den transgena TCRα kedjan vid DN stadiet, vilket resulterar i för tidig negativ selektion. Vårt laboratorium har utvecklat HY CD4-modellen, där transgena HY TCRα är villkorligt uttryck i DP stadiet, vilket negativt urval ske under DP SP övergång som sker i vildtyp möss 10.
Här beskriver vi ett flödescytometri-baserat protokoll för att undersöka tymus positiv och negativ selektion i HY CD4 musmodellen. Medan negativ selektion i HY CD4 möss är mycket fysiologisk, kan dessa metoder även tillämpas på andra TCR transgena modeller. Vi kommer också att presentera övergripande strategier för att analysera positiv selektion i en polyklonal repertoar som gäller för alla genetiskt manipulerade möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här kan användas för att undersöka positiv och negativ selektion i icke-TCR transgena och TCR-transgena möss. Detta protokoll beskriver färgning av ytantigener. För ytterligare analys av molekylära mekanismer, är det ofta nödvändigt att utföra intracellulär färgning. Vi använder BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit för de flesta intracellulära proteiner och BD Biosciences Foxp3 färgningskit för transkriptionsfaktorer. Vi förvärvar brukar våra prover direkt efter färgni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Bing Zhang för hans tekniskt bistånd. Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Institutes for Health Research (MOP-86.595). TAB är en CIHR ny utredare och AHFMR Scholar. QH stöds av en CIHR Canada Graduate Scholarship – Utbildning och AIHS Heltid STUDENTTILLVARO. SAN stöds av en drottning Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS stöds av en NSERC Utbildningsbidrag – Utbildning.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| HyClone Hank’s balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss – Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences – FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI – 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
Riferimenti
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage–limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
