JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Published: December 20, 2012
doi:
10.3791/4274
, , , , ,
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler çoğalmaya<em> In vitro</em> Nöron ve astrosit içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak. Bu çalışma nöral ataları select büyüme faktörleri ile klima tarafından oligodendrocytic soy aşamalarında farklılaştırmak için ikna edilebilmesi gösterir.

Abstract

Nöronal ve glial hücre tipleri içine insan nöral ataları Farklılaşma nöral hücre soyu gelişmenin moleküler düzenlenmesi incelemek ve karşılaştırmak için bir model sunuyor. Fetal MSS dokusu nöral progenitörlerinin vitro genişlemesi de karakterize edilmiştir. In vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit edinme miyelin üreten oligodentrositlere fetal nöral ataları, doğrudan farklılaşma çeşitli kültür şartlarının yetişkin insan subkortikal beyaz cevher ve geliştirme glial progenitörlerin tespiti ve izolasyonu rağmen zor kalır. Galactocerebroside + (GalC) ve O4 Farklılaşma + oligodendrosit habercisi veya nöral prekürsör hücrelerden progenitör hücrelerin (OPC) ikinci trimesterde fetal beyin kullanarak rapor edilmiştir. Ancak, bu hücreler astrositler ve nöronlar da dahil olmak üzere destek hücrelerin yokluğunda çoğalırlar yok, ve kültür zaman içinde hızla kaybolur. Gerek in vitro deneyler için uygun soy oligodendrosit hücreleri üretmek için bir kültür sistemi için devam etmektedir.

Primer oligodendrosit insan kültürü, örneğin, in vivo olarak bu hücreleri enfekte eden insan polyomavirus, JCV gibi nörotropik bulaşıcı ajanların patogenezine incelemek için yararlı bir model olabilir. Bu kültür hücreleri aynı zamanda merkezi sinir sistemi (MSS) diğer demiyelinizan hastalıkların modelleri sağlayabilir. Nöronlar (progenitör türetilmiş nöronlar, PDN) ve astrositler (progenitör türetilmiş astrositler, PDA) Bu çalışmada nöral ataları ikna edilebilmesi göstermektedir içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential nöral progenitör hücrelerin in vitro prolifere oligodendrocytic soy geliştirme aşamaları (progenitör türetilmiş oligodendrosit, PDO) birçok yoluyla ayırt etmek. DMEM-F12 serum serbest medya Biz kültür nöral progenitör hücrelerin suptemel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA), Sonic kirpi (Sus), nörotrofik faktör 3 (NT-3), N-2 ve triiyodotironin (T3) ile yürütülecek. Kültürlü hücreler yaklaşık her yedi günde 75cm matara başına 2.5e6 hücrelerini pasajlanmağa edilmektedir. Bu koşullar kullanılarak, kültürdeki hücrelerin çoğunluğunun az süreçleri ve bu gibi A2B5 ve O-4 gibi ön-oligodendrosit hücreleri, açık belirteçleri ile karakterize edilen bir morfoloji korumak. Biz dört büyüme faktörleri (GF) (bFGF, PDGF-AA, Şşş, NT-3) çıkarın ve PDN şartlandırılmış ortam eklerken, hücreler gibi GalC ve myelin oligodendrosit farklılaşma belirli daha süreçleri ve ekspres belirteçler, elde başlar bazik protein (MBP). Biz oligodendrosit eşsiz belirteçler tanımlamak amacıyla renkli akım sitometri kullanılarak fenotipik karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.

Protocol

Not: öncül ve nöral oligodendrocytic soy hücreleri rutin kültürü için inkübasyon 37 ° C'de nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosfer içinde gerçekleştirilir. Her 2 gün, kültür ortamı% 40-70 oranında konfluent ise taze aracı madde içinde 50 ila% 100 kullanılarak değiştirilir. Yakınlarındaki confluency sırasında, kültürler genellikle bir haftalık çalışma programı üzerinde 2-2.5e6/T75 şişeyi de geçişli edilmektedir. 1. Kaplı Flask …

Representative Results

Bu 70% -80% konfluent nöral progenitör hücre kültürü (Şekil 1A) gelen farklılaşma sürecini başlatmak için çok önemlidir. Birçok hücreler spesifik büyüme faktörleri içeren yana progenitör gelen oligo orta kültür ortamı değiştirdikten sonra ölecek. Bu oligodendrocytic fenotipi vermeyenleri nöral progenitör hücrelerin büyüme yeni orta (Şekil 1B) tarafından desteklenen olmayacağını belirtir. Bir hafta boyunca oligo orta + GF Kuluçka dar bir, iki kutuplu…

Discussion

Bu protokol, birincil insan nöral progenitör hücrelerin fetal oligodendrosit türetmek ve flow sitometri ve immünfloresan boyama kullanarak hem kendi fenotip karakterize açıklamaktadır. Fetal CNS sinir progenitörlerinin genişleme ve büyüme çok iyi 1-4 tarif edilmiştir. Erişkin insan beyaz madde 5-13 glial öncüleri tanımlamak ve ayırmak mümkün olsa bile Ancak, in vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit elde, zor kalır. Oligodendrosit 14-21 üreten m…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NINDS de İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar düzenleme ile yardım için mikroskop ve Pamela C. Eleme ile yardım için Moleküler Tıp ve Nörobilim, Rick Dreyfuss ve Laboratuvar tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Final concentration
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI		 Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.
Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500) 		Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		 Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D’Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).

Tags

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture SystemHuman Fetal BrainDifferentiationNeural ProgenitorsNeuronal Cell TypesGlial Cell TypesMolecular RegulationNeural Cell Lineage DevelopmentIn Vitro ExpansionGlial ProgenitorsSub-cortical White MatterCulture ConditionsMyelin Producing OligodendrocytesGalactocerebroside+O4+ Oligodendrocyte Precursor Or Progenitor Cells (OPC)Neural Precursor CellsSupport Cells (astrocytes And Neurons)Culture SystemIn Vitro ExperimentationPrimary Human OligodendrocytesPathogenesisNeurotropic Infectious Agents (human PolyomavirusJCV)Demyelinating DiseasesCentral Nervous System (CNS)
check_url/it/4274?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image