Progénitrices dérivées de Système de culture Oligodendrocyte du cerveau foetal humain
Summary
Primaire, l'homme dérivés du cerveau du fœtus, des cellules progénitrices multipotentes prolifèrent<em> In vitro</em> Tout en maintenant la capacité de se différencier en neurones et les astrocytes. Ce travail montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites à se différencier par des étapes de la lignée oligodendrogliome par le conditionnement des facteurs de croissance choisis.
Abstract
Différenciation des progéniteurs neuronaux de l'homme dans les types de cellules neuronales et gliales propose un modèle pour étudier et comparer la régulation moléculaire du développement neuronal lignée cellulaire. En expansion in vitro des progéniteurs neuronaux du tissu du SNC du fœtus a été bien caractérisée. Malgré l'identification et l'isolement des progéniteurs gliales de l'adulte humain sous-corticale de la substance blanche et le développement des conditions de culture différentes de différenciation directe des cellules progénitrices neurales foetales en oligodendrocytes de myéline produire, acquérir suffisamment oligodendrocytes humains pour une expérimentation in vitro reste difficile. Différenciation des galactocérébroside + (GalC) et O4 + précurseurs d'oligodendrocytes ou cellules progénitrices (OPC) à partir de cellules précurseurs neurales ont été signalés à l'aide du cerveau du fœtus deuxième trimestre. Cependant, ces cellules ne prolifèrent en l'absence de cellules de soutien, y compris les astrocytes et les neurones, et se perdent rapidement au fil du temps dans la culture. Il subsiste le besoin d'un système de culture pour produire des cellules de la lignée oligodendrocytaire apte à une expérimentation in vitro.
Culture des oligodendrocytes humains primaires pourrait, par exemple, être un modèle utile pour étudier la pathogenèse de la neurotropes agents infectieux comme le polyomavirus humain, JCV, que in vivo infecte ces cellules. Ces cellules en culture pourrait également fournir des modèles d'autres maladies de démyélinisation du système nerveux central (SNC). Primaire, du fœtus humain dérivé du cerveau, les cellules progénitrices neurales pluripotentes proliférer di vitro tout en conservant la capacité de se différencier en neurones (progéniteurs des neurones dérivés, PDN) et les astrocytes (progéniteurs dérivés des astrocytes, PDA) Cette étude montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites se différencier grâce à de nombreux stades de développement lignée oligodendrogliome (progéniteurs des oligodendrocytes dérivées, AOP). Nous cellules progénitrices neurales culture dans du DMEM-F12 sans sérum supplemented avec le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), le facteur neurotrophique 3 (NT-3), N-2 et de la triiodothyronine (T3). Les cellules cultivées sont passées à cellules 2.5e6 par flacons de 75 cm environ tous les sept jours. L'utilisation de ces conditions, la plupart des cellules en culture maintenir une morphologie caractérisée par quelques procédés et expriment des marqueurs de cellules pré-oligodendrocytes, telles que A2B5 et O-4. Quand nous enlevons les facteurs de croissance quatre (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) et ajouter milieux conditionnés provenant de PDN, les cellules commencent à acquérir davantage de processus et de marqueurs spécifiques expresses de la différenciation des oligodendrocytes, comme GalC et de la myéline protéine de base (MBP). Nous avons effectué la caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multicolores pour identifier des marqueurs uniques de oligodendrocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit la façon de calculer les oligodendrocytes à partir de fœtus humains primaires cellules progénitrices neurales et de caractériser leur phénotype en utilisant la cytométrie en flux à la fois et immunofluorescence. L'expansion et la croissance des progéniteurs neuronaux du système nerveux central du fœtus a été très bien décrit 1-4. Cependant, l'obtention d'oligodendrocytes humains suffisants pour une expérimentation in vitro reste difficile, mê…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros au National Institutes of Health, NINDS. Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du Laboratoire de médecine moléculaire et de neurosciences, Rick Dreyfuss pour aider à la microscopie et Pamela C. Tamiser pour son aide à l'édition.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
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Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
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Riferimenti
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