Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn
Summary
Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente Vorläuferzellen<em> In vitro</em> Gleichzeitig die Fähigkeit, sich in Neuronen und Astrozyten differenzieren. Diese Arbeit zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden durch Phasen des oligodendrocytic Linie durch Konditionierung mit ausgewählten Wachstumsfaktoren zu unterscheiden.
Abstract
Differenzierung von humanen neuronalen Vorläuferzellen in neuronale und gliale Zelltypen ein Modell zu studieren und Vergleichen molekulare Regulation von neuronalen Zellstammbaums Entwicklung. In vitro Expansion von neuralen Vorläuferzellen aus fötalem ZNS-Gewebe ist gut charakterisiert worden. Trotz der Identifizierung und Isolierung von glialen Vorläuferzellen aus adulten menschlichen subkortikalen weißen Substanz und Entwicklung verschiedener Kulturbedingungen direktem Differenzierung von fötalen neuralen Vorläuferzellen in Myelin Herstellung Oligodendrozyten, Erhaltens ausreichender menschlichen Oligodendrocyten für in vitro Experimente ist weiterhin schwierig. Differenzierung Galactocerebrosid + (GalC) und O4 + Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder Vorläuferzellen (OPC) aus neuralen Vorläuferzellen wurde berichtet, mit zweiten Trimester fetalen Gehirns. Allerdings sind diese Zellen nicht proliferieren in Abwesenheit von Stützzellen einschließlich Astrozyten und Neuronen und schnell über die Zeit in Kultur verloren. Der Bedarf bleibt für eine Kultur-System an Zellen des Oligodendrozyten Linie geeignet für in vitro Experimente erzeugen.
Kultur von primären humanen Oligodendrozyten könnte beispielsweise ein nützliches Modell für die Pathogenese von neurotropen Infektionserreger wie das menschliche Polyomavirus, JCV, die in vivo infiziert jene Zellen zu studieren. Diese kultivierten Zellen konnten auch Modelle von anderen demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Primary, humanen fötalen brain-derived vermehren multipotente neurale Vorläuferzellen in vitro unter Beibehaltung der Fähigkeit, sich in Neuronen (Vorläuferzellen abgeleiteten Neuronen, PDN) und Astrozyten (Vorläuferzellen abgeleitete Astrozyten, PDA) Diese Studie zeigt, dass neuronale Vorläuferzellen induziert werden kann differenzieren durch viele der Stufen oligodendrocytic Linie Entwicklung (Vorläuferzellen abgeleitete Oligodendrozyten, PDO) zu unterscheiden. Wir Kultur neuralen Vorläuferzellen in DMEM-F12 serum-freien Medien unterstütztumgesetzt mit basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), neurotrophen Faktor 3 (NT-3), N-2 und Trijodthyronin (T3). Die kultivierten Zellen werden bei 2.5e6 Zellen pro 75cm Flaschen etwa alle 7 Tage passagiert. Mit diesen Bedingungen behält die Mehrzahl der Zellen in Kultur eine Morphologie von wenigen Prozessen und Express Marker des Pre-Oligodendrozyten-Zellen, wie A2B5 und O-4 ist. Wenn wir die vier Wachstumsfaktoren (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) entfernen und konditionierten Medien von PDN, beginnen die Zellen zu mehreren Prozesse und Express Marker spezifische Differenzierung der Oligodendrozyten, wie GalC und Myelin erwerben basisches Protein (MBP). Wir führten phänotypischen Charakterisierung mit multicolor Durchflusszytometrie einzigartige Marker der Oligodendrozyten zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Ableitung fetaler Oligodendrozyten aus primären humanen neuralen Vorläuferzellen und zu charakterisieren ihren Phänotyp sowohl mit Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz. Der Ausbau und das Wachstum von neuralen Vorläuferzellen aus fetalem ZNS wurde sehr gut 1-4 beschrieben. Allerdings erhalten ausreichende personelle Oligodendrozyten in vitro Experimente bleibt schwierig, obwohl es möglich ist, zu identifizieren und zu isolieren, glialen Vorläuferzellen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Intramural Research Program des National Institutes of Health, NINDS unterstützt. Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Labors für Molekulare Medizin und Neurowissenschaften, Rick Dreyfuss für die Hilfe bei Mikroskopie und Pamela C. Sieben für die Hilfe bei der Bearbeitung danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
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Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
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Riferimenti
- Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
- Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
- Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
- Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
- Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
- Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
- Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
- Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
- Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
- Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
- Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
- Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
- Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
- Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
- D’Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
- Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
- Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
