Stamfar-avledet Oligodendrocyte Kultur System fra Human fosterets hjerne
Summary
Primær, menneskelige hjernens-deriverte, multipotential stamceller sprer<em> In vitro</em> Mens opprettholde evnen til å differensiere til neuroner og astrocytes. Dette arbeidet viser at nevrale stamceller kan bli overtalt til å skille gjennom stadier av oligodendrocytic avstamning av condition med utvalgte vekstfaktorer.
Abstract
Differensiering av menneskelige nevrale stamceller i neuronal og glial celletyper tilbyr en modell for å studere og sammenligne molekylær regulering av neural celle avstamning utvikling. In vitro utvidelse av nevrale stamceller fra foster CNS vev har blitt godt karakterisert. Til tross for identifisering og isolering av glial stamfedre fra voksent menneske sub-kortikal hvit materie og utvikling av ulike kultur betingelser for direkte differensiering av fosterets nevrale stamceller i myelin produserende oligodendrocytes, anskaffe tilstrekkelige menneskelige oligodendrocytes for in vitro eksperimentering er fortsatt vanskelig. Differensiering av galactocerebroside + (GalC) og O4 + oligodendrocyte forløper eller stamceller (OPC) fra nevrale forløper celler er rapportert ved hjelp andre trimester fosterets hjerne. Men disse cellene ikke sprer i fravær av støtte celler inkludert astrocytes og nerveceller, og er tapt raskt over tid i kultur. Behovet fortsatt for en kultur-system for å produsere celler av oligodendrocyte avstamning egnet for in vitro forsøk.
Dyrkning av primære humane oligodendrocytes kunne, for eksempel, være en nyttig modell for å studere patogenesen av neurotropisk smittestoffer som menneskelige polyomavirus, JCV at in vivo infiserer disse cellene. Disse dyrkede celler kunne også gi modeller av andre demyeliniserende sykdommer i det sentrale nervesystemet (CNS). Primær, human fosterets hjerne-avledet, multipotential nevrale stamceller sprer in vitro og samtidig opprettholde evnen til å differensiere i nevroner (stamfar-avledet nevroner, PDN) og astrocytes (stamfar-avledet astrocytes, PDA) Denne studien viser at nevrale stamceller kan induseres å skille gjennom mange av de stadier av oligodendrocytic avstamning utvikling (stamfar-avledet oligodendrocytes, PUD). Vi kultur nevrale stamceller i DMEM-F12 serum-frie medier supiverksatt med grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), blodplate avledet vekstfaktor (PDGF-AA), Sonic pinnsvin (SHH), neurotrop faktor 3 (NT-3), N-2 og trijodtyronin (T3). Dyrkede celler passaged på 2.5e6 celler per 75cm kolber omtrent hvert sju dager. Ved hjelp av disse forhold, flertallet av celler i kultur opprettholde en morfologi preget av få prosesser og uttrykke markører av pre-oligodendrocyte celler, for eksempel A2B5 og O-4. Når vi fjerner de fire vekstfaktorer (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) og legge kondisjonert medium fra PDN, cellene begynner å anskaffe flere prosesser og uttrykke markører spesifikke for oligodendrocyte differensiering, for eksempel GalC og myelin grunnleggende protein (MBP). Vi utførte fenotypisk karakterisering ved hjelp av flerfarget flowcytometri å identifisere unike markører for oligodendrocyte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan man utlede fosterets oligodendrocytes fra primære humane nevrale stamceller og karakterisere deres fenotype med både flowcytometri og immunfluorescens flekker. Utvidelsen og vekst av nevrale stamceller fra foster CNS har vært veldig godt beskrevet 1-4. Imidlertid, å skaffe tilstrekkelige menneskelige oligodendrocytes for di vitro eksperimentering fortsatt vanskelig, selv om det er mulig å identifisere og isolere glial forløpere fra voksen human hvit …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program ved National Institutes of Health, NINDS. Forfatterne ønsker å takke alle medlemmene av Laboratory of Molecular Medicine og nevrovitenskap, Rick Dreyfuss for å hjelpe med mikroskopi og Pamela C. sikting for å hjelpe med redigering.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Riferimenti
- Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
- Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
- Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
- Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
- Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
- Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
- Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
- Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
- Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
- Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
- Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
- Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
- Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
- Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
- D’Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
- Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
- Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
