Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano
Summary
Primario, fetales humanos derivado del cerebro, células progenitoras multipotenciales proliferan<em> In vitro</em> Mientras se mantiene la capacidad de diferenciarse en neuronas y astrocitos. Este trabajo muestra que los progenitores neurales pueden ser inducidas a diferenciarse a través de las etapas del linaje oligodendrocíticos por aire con factores de crecimiento seleccionados.
Abstract
La diferenciación de los progenitores neurales humanas en tipos de células neuronales y gliales ofrece un modelo para estudiar y comparar la regulación molecular del desarrollo neural linaje celular. Expansión di vitro de células progenitoras neurales a partir de tejido del SNC fetal ha sido bien caracterizado. A pesar de la identificación y el aislamiento de células progenitoras gliales de adulto humano sub-cortical materia blanca y el desarrollo de diversas condiciones de cultivo para la diferenciación directa de progenitores neurales fetales en oligodendrocitos de mielina producir, adquirir suficientes oligodendrocitos humanos para la experimentación in vitro sigue siendo difícil. Diferenciación de galactocerebrósido + (GalC) y O4 + precursoras de oligodendrocitos o células progenitoras (OPC) a partir de células precursoras neurales ha informado mediante cerebro fetal segundo trimestre. Sin embargo, estas células no proliferan en ausencia de células de apoyo incluyendo los astrocitos y las neuronas, y se pierden rápidamente con el tiempo en cultivo. Persiste la necesidad de un sistema de cultivo para producir las células del linaje de oligodendrocitos adecuado para la experimentación in vitro.
Cultura de oligodendrocitos humanos primarios podría, por ejemplo, ser un modelo útil para estudiar la patogénesis de la neurotrópicos agentes infecciosos como el virus de polioma humano, JCV, que in vivo infecta las células. Estas células cultivadas también podrían proporcionar modelos de otras enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central (SNC). Primario, humano fetal derivado del cerebro, las células progenitoras neurales multipotenciales proliferan di vitro, mientras que el mantenimiento de la capacidad de diferenciarse en neuronas (neuronas derivadas progenitor-, PDN) y astrocitos (derivado progenitor-astrocitos, PDA) Este estudio muestra que los progenitores neurales pueden ser inducidas para diferenciar a través de muchas de las etapas del desarrollo de linaje oligodendrocíticos (derivado progenitor-oligodendrocitos, PDO). Nosotros, las células progenitoras neurales en cultivo DMEM-F12 sin suero supcomplementado con factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), factor neurotrófico 3 (NT-3), N-2 y triyodotironina (T3). Las células cultivadas se someten a pasadas en células 2.5e6 por matraces de 75 cm aproximadamente cada siete días. Usando estas condiciones, la mayoría de las células en cultivo mantener una morfología caracterizada por pocos procesos y expresan marcadores de oligodendrocitos pre-células, tales como A2B5 y O 4-. Cuando eliminar los factores de crecimiento de cuatro (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) y añadir medio acondicionado de PDN, las células comienzan a adquirir más procesos y expresan marcadores específicos de diferenciación de oligodendrocitos, tales como GalC y de la mielina proteína básica (MBP). Se realizó la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo multicolor para identificar marcadores únicos de oligodendrocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la forma de obtener los oligodendrocitos fetales a partir de células humanas primarias progenitoras neurales y caracterizar su fenotipo utilizando tanto la citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia. La expansión y el crecimiento de células progenitoras neurales fetales desde CNS ha sido muy bien descrita 1-4. Sin embargo, la obtención de suficientes oligodendrocitos humanos para la experimentación in vitro sigue siendo difícil, a pesar de que es pos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Salud, NINDS. Los autores desean agradecer a todos los miembros del Laboratorio de Medicina Molecular y Neurociencias, Rick Dreyfuss por ayudar con microscopía y tamizado Pamela C. por su ayuda en la edición.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
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Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
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Riferimenti
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