Progenitor-härledda oligodendrocyt Kultur System från human fetal hjärna
Summary
Primär, mänskliga fostrets hjärna-derived, multipotentiella progenitorceller förökar<em> In vitro</em> Samtidigt som förmågan att differentiera till neuroner och astrocyter. Detta arbete visar att neurala stamceller kan induceras att differentiera genom stegen i oligodendrocytic härstamning genom konditionering med utvalda tillväxtfaktorer.
Abstract
Differentiering av humana neurala stamceller i neuronala och glia celltyper erbjuder en modell för att studera och jämföra molekylära regleringen av neurala celler härstamning utveckling. In vitro expansion av neurala stamceller från foster CNS-vävnad har väl karakteriserade. Trots identifiering och isolering av gliala progenitorceller från vuxen människa subkortikal vita substansen och utveckling av olika odlingsbetingelser för direkt differentiering av fetala neurala stamceller till myelin producerar oligodendrocyter, förvärva tillräckliga personalresurser oligodendrocyter för in vitro experiment är fortfarande svårt. Differentiering av galaktocerebrosid + (GalC) och O4 + har oligodendrocyt föregångare eller stamfaderceller (OPC) från neurala prekursorceller rapporterats med andra trimestern fostrets hjärna. Emellertid dessa celler prolifererar inte i frånvaro av stödceller innefattande astrocyter och neuroner, och försvinner snabbt över tiden i odling. Behovet kvarstår för en kultur för att producera celler av oligodendrocyt härstamning lämplig för in vitro-experiment.
Odling av primära humana oligodendrocyter kan, exempelvis, vara en användbar modell för att studera patogenesen för neurotropa smittämnen såsom humana polyomavirus, JCV, att in vivo infekterar dessa celler. Dessa odlade celler kan också ge modeller för andra demyeliniserande sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS). Primär human fetal hjärna-derived, multipotentiella neurala stamceller förökar in vitro samtidigt som förmågan att differentiera till neuron (stamfader-härledda neuroner, PDN) och astrocyter (stamfader härledda astrocyter, PDA) Denna studie visar att neurala stamceller kan induceras att differentiera genom många av de olika stadierna i oligodendrocytic härstamning utveckling (stamfader-härledda oligodendrocyter, SUB). Vi kultur neurala progenitorceller i DMEM-F12 serumfritt medium supkompletterat med basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrofisk faktor 3 (NT-3), N-2 och trijodtyronin (T3). De odlade cellerna passeras vid 2.5e6 celler per 75cm kolvar ungefär var sjunde dag. Med användning av dessa betingelser, majoriteten av cellerna i odling bibehålla en morfologi kännetecknas av få processer och uttrycka markörer för pre-oligodendrocytceller, såsom A2B5 och O-4. När vi tar bort de fyra tillväxtfaktorer (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) och lägg konditionerade media från PDN, cellerna börjar få fler processer och uttrycka markörer specifika för oligodendrocyt differentiering, såsom GalC och myelin basiskt protein (MBP). Vi utförde fenotypisk karaktärisering med multicolor flödescytometri för att identifiera unika markörer för oligodendrocyt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man härleda foster oligodendrocyter från primära humana neurala stamceller och karakterisera deras fenotyp med både flödescytometri och immunofluorescensfärgning. Expansion och tillväxt av neurala stamceller från foster CNS har mycket väl beskriven 1-4. Men få tillräckliga personalresurser oligodendrocyter för in vitro experiment fortfarande svårt, även om det är möjligt att identifiera och isolera gliaceller prekursorer från vuxen människa vita substan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram vid National Institutes of Health, NINDS. Författarna vill tacka alla medlemmar i laboratoriet för molekylär medicin och neurovetenskap, Rick Dreyfuss för att hjälpa till med mikroskopi och Pamela C. Siktning för att hjälpa till med redigering.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Riferimenti
- Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
- Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
- Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
- Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
- Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
- Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
- Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
- Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
- Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
- Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
- Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
- Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
- Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
- Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
- D’Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
- Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
- Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
