CRISPR / Cas systèmes médiate immunité adaptative dans les bactéries et les archées. De nombreuses protéines sont proposées Cas d'agir comme endoribonucléases agissant sur les précurseurs crRNA de longueur variable. Ici, nous illustrons trois approches différentes pour générer des pré-crRNA substrats pour l'analyse biochimique de l'activité endonucléase de Cas.
L'interaction des virus et leurs hôtes procaryotes façonné l'évolution de la vie bactérienne et Archaea. Les procaryotes développé plusieurs stratégies pour échapper aux attaques virales qui comprennent la modification restriction, infection abortive et CRISPR / Cas des systèmes. Ces systèmes immunitaires adaptatives trouvés dans de nombreuses bactéries et les archées se composent de plus lustré c r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) et un certain nombre de séquences de C RISPR que sociated (CAS) gènes (Fig. 1) 1-3. Différents ensembles de protéines Cas et répète définir au moins trois grands types divergents de CRISPR / Cas systèmes 4. Les protéines universelles CAS1 et CAS2 sont proposées pour être impliqués dans l'absorption de l'ADN viral quigénère un nouveau élément d'écartement entre deux répétitions à l'extrémité 5 'd'une grappe CRISPR s'étendant 5. L'ensemble du cluster est transcrit en un précurseur contenant tous crRNA-entretoise et des séquences répétées et est ensuite traité par une enzyme de la famille diversifiée Cas6 en petits crRNAs 6-8. Ces crRNAs constitués de la séquence flanquée par une entretoise 5 'terminale (8 nucléotides) et une région 3' terminale variable dérivée de la séquence répétée 9. Une infection répétée du virus peuvent maintenant être bloqué comme la nouvelle crRNA sera dirigé par un complexe protéique Cas (Cascade) à l'ADN viral et l'identifier comme tel via 10 la complémentarité de base. Enfin, pour CRISPR / Cas des systèmes de type 1, le CAS3 nucléase va détruire l'envahisseur détecté l'ADN 11,12.
Ces processus définissent CRISPR / Cas en tant que système immunitaire adaptatif des procaryotes et a ouvert un domaine de recherche fascinant pour l'étude des protéines impliquées Cas.La fonction d'un grand nombre de protéines Cas est toujours insaisissable et les causes de la diversité apparente des systèmes CRISPR / Cas restent à éclairer. Les activités potentielles de la plupart des protéines ont été prédites par Cas des analyses détaillées de calcul. Une fraction importante de protéines Cas sont soit montré ou proposé à fonctionner comme endonucléases 4.
Ici, nous présentons les méthodes pour générer des précurseurs et crRNAs-ARNc pour l'étude de Cas endoribonucléases. Dosages différents exigent des endonucléases de séquences répétées courtes soit qui peuvent être directement synthétisés comme oligonucléotides d'ARN ou des séquences plus crRNA et pré-crRNA qui sont générés in vitro par l'ARN polymérase T7 de ruissellement de la transcription. Cette méthodologie permet l'incorporation de nucléotides radioactifs pour la production de substrats marqués endonucléase interne et la création de crRNAs synthétiques ou mutant. Cas6 activité endonucléase est utilisé pour mûrir pré-crRNAs en crRNAs avec 5'-hydroxyle et un 2 ', 3'-terminales phosphate cyclique.
Les méthodes présentées permettent la génération de substrats endonucléase SAE de gammes de tailles différentes et avec plus ou moins de liberté dans la conception de séquence. L'approche la plus straight-forward pour la génération de substrats synthétiques d'oligonucléotides d'ARN est limitée à de courtes créations d'ARN en raison de l'augmentation des coûts et des limitations techniques dans la création de plus oligomères d'ARN. Bien réussir la synthèse d'ARN a été rapportée pour les oligomères d'ARN non modifiés de plus de 100 nucléotides de longueur, le maximum pratique et économique pour l'ARN de synthèse sur mesure est inférieure à 40 nucléotides. Cependant, toute séquence donnée peut être synthétisé et l'introduction ciblée de nucléotides modifiés (par exemple désoxyribonucléotides) peut être utilisé pour analyser des sites de clivage dans le détail. Plus pré-ARNc doit être généré par transcription di vitro.
Le recuit d'oligonucléotides qui contiennent un promoteur de T7 ARN polymérase permet la production d'une longueur intermédiaire de pré-CRRNComme. La longueur maximale de routine et économiquement oligonucléotides d'ADN synthétisés se trouve au-dessus de 150 nucléotides et représente le maximum de pré-synthèse crRNAs par cette méthode. L'assemblage de plusieurs paires d'oligonucléotides d'ADN recuit qui forment des extrémités cohésives avec l'autre peut étendre cette durée maximale, mais nécessite des défis croissants dans le clonage de la construction. Le principal avantage de cette méthode est sa capacité à générer des pré-crRNA constructions (et donc Cas endonucléase de substrats) avec un ordre quelconque. Ceci permet à l'essai de prototypes de crRNA synthétiques.
Enfin, les grandes pré-crRNAs peut être obtenu à partir de produits d'amplification PCR des éléments entiers CRISPR génomiques ou en fractions. Des altérations de la transcription in vitro dans le modèle plasmide peut être introduit par mutagénèse dirigée pour la génération de pré-crRNA variantes. Ces constructions peuvent être utilisées pour analyser le motif de clivage mondial endonucléolytique au sein d'un ensemblepré-crRNA.
Le travail de pionnier pour la production d'ARN non modifié par l'ARN polymérase T7 transcription di vitro a été basée sur 14 ARN de transfert et ARN virus de la mosaïque du brome 15. Le promoteur consensus T7 ARN polymérase est constituée d'un domaine de reconnaissance (-17 à travers -5) et un domaine d'initiation (-4 à travers +6) avec initiation de la transcription à une guanosine essentiel +1 16. En aval des postes de +1 peut être variée qui permet la transcription de presque toute séquence d'ARN désiré. Les méthodes présentées pour générer des modèles de transcription in vitro de ruissellement pour permettre la synthèse in vitro de pré-complets qui correspondent à des régions crRNAs CRISPR génomique ou synthétique pré-crRNA variantes. Les transcrits sont générés en présence d'un triphosphate 5'-terminale à moins que la réaction de transcription est amorcée avec GMP pour obtenir 5 'monophosphate extrémités 14. Ces terminaisons sont nécessaires si les relevés de notes doivent être étiquetésla T4 polynucléotide kinase et γ-[32P]-ATP. Activité de clivage de Cas6 et Cas6 enzymes analogues génère crRNA qui contiennent 5'-hydroxyle et un 2 ', 3'-phosphate extrémités cycliques. Ces ARN peuvent ensuite être analysées pour la reconnaissance par le complexe Cascade.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Jeanette Schermuly pour la préparation de recombinaison ARN polymérase T7 et Ebelt Norman pour l'assistance dans la préparation de la figure 1. Ce travail a été financé par des fonds de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) et la Société Max Planck.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |