CRISPR / Cas sistemas mediato imunidade adaptativa em Bacteria e Archaea. Muitas proteínas Cas são propostos para agir como endoribonucleases actuam sobre precursores crRNA de comprimento variável. Aqui, ilustramos três abordagens diferentes para gerar pré-crRNA substratos para a análise bioquímica da actividade de endonuclease Cas.
A interação do vírus e seus hospedeiros procarióticos moldaram a evolução da vida de bactérias e Archaea. Procariotos desenvolveram várias estratégias para evitar ataques virais que incluem a modificação restrição, infecção abortiva e CRISPR / Cas sistemas. Estes sistemas adaptativos imunes encontrados em muitas bactérias e mais Archaea consistem em c Abrilhantado r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) e um número de sequências de C RISPR como associada (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Conjuntos diferentes de proteínas Cas e repete definir pelo menos três grandes tipos divergentes de CRISPR / Cas sistemas 4. As proteínas e universais CAS1 CAS2 são propostas a serem envolvidas na absorção do DNA viral quegerará um elemento espaçador entre duas repetições na extremidade 5 'de um cluster CRISPR estendendo 5. O conjunto inteiro é transcrito em um precursor crRNA contendo todos espaçador e sequências de repetição e é posteriormente processado por uma enzima da família Cas6 diversificada em crRNAs menores 6-8. Estes consistem crRNAs da sequência flanqueada por um espaçador 5 'terminal (8 nucleótidos) e um 3' terminal de tag derivada da sequência de repetição 9. A infecção repetida do vírus pode agora ser bloqueada como o crRNA novo será dirigido por um complexo de proteína Cas (Cascade) para o ADN virai e identifica-o como tal através da complementaridade de base 10. Finalmente, para CRISPR / Cas tipo 1 sistemas, o CAS3 nuclease vai destruir o invasor detectado ADN 11,12.
Esses processos definem CRISPR / Cas como um sistema imune adaptativo de procariotas e aberto um campo de pesquisa fascinante para o estudo das proteínas envolvidas Cas.A função de muitas proteínas Cas ainda é evasivo e as causas da aparente diversidade dos sistemas CRISPR / Cas continuam a ser iluminado. Atividades potenciais da maioria das proteínas Cas foram previstos através de análises detalhadas computacionais. A maior fracção de proteínas Cas ou são mostrados ou propostas para funcionar como endonucleases 4.
Aqui, apresentamos métodos para gerar crRNAs e precursor-CRNAs para o estudo da endoribonucleases Cas. Os ensaios de endonucleases diferentes requerem sequências de repetição ou curtas que podem ser directamente sintetizados como oligonucleótidos de ARN ou sequências mais crRNA e pré-crRNA que são geradas in vitro por meio de polimerase de ARN de T7 a transcrição run-off. Esta metodologia permite a incorporação de nucleótidos radioactivos para a produção de substratos de endonuclease internamente marcadas e da criação de crRNAs sintéticos ou mutante. Cas6 actividade endonuclease é utilizado para pré-crRNAs amadurecer em crRNAs com 5'-hidroxilo e um 2 ', 3'-terminais cíclicos fosfato.
Os métodos apresentados permitem a geração de substratos Cas endonucleases de gamas de tamanhos diferentes e com diferentes liberdade no desenho sequência. A abordagem mais simples e direta para a geração de substratos de oligonucleótidos sintéticos de ARN está limitada a designs de ARN curtos devido ao aumento dos custos e as limitações técnicas na criação de oligómeros mais longos de RNA. Enquanto a síntese de RNA de sucesso tem sido relatado para oligómeros não modificados de RNA de nucleótidos ao longo do comprimento de 100, o máximo prático e económico para a síntese de RNA personalizado está abaixo de 40 nucleótidos. No entanto, qualquer dada sequência pode ser sintetizado e a introdução orientada dos nucleótidos modificados (por exemplo, desoxirribonucleótidos) pode ser utilizada para analisar locais de clivagem em detalhe. Mais longos de pré-CRNAs deve ser gerada através de transcrição di vitro.
O recozimento de oligonucleótidos que contêm um promotor de ARN-polimerase de T7 permite a produção de comprimento intermédio pré-CRRNComo. O comprimento máximo de rotina e economicamente oligonucleótidos de ADN sintetizadas está apenas acima de 150 nucleótidos e representa o máximo de síntese pré-crRNAs através deste método. A montagem dos vários pares de oligonucleótidos de ADN hibridados que formam extremidades coesivas com o outro pode estender este comprimento máximo mas necessita desafios crescentes na clonagem do construto. A principal vantagem deste método é a capacidade para gerar pré-crRNA construções (e, portanto, Cas endonuclease substratos) com qualquer sequência desejada. Isto permite que o teste de modelos crRNA sintéticos.
Finalmente, os pré-crRNAs maiores podem ser obtidos a partir de PCR amplificados de elementos genómicos CRISPR inteiras ou fracções dos mesmos. Alterações ao modelo in vitro de transcrição do plasmídeo pode ser introduzido, através de mutagénese dirigida para a produção de pré-crRNA variantes. Estas construções podem ser usadas para analisar o padrão de clivagem endonucleolítica mundial dentro de um inteiropré-crRNA.
O trabalho pioneiro para a produção de ARN não modificado através de T7 RNA polimerase de transcrição in vitro foi baseada em RNAs de transferência 14 e do vírus do mosaico brome RNA 15. O consenso do promotor T7 RNA polimerase consiste de um domínio de reconhecimento (-17 a -5) e um domínio de iniciação (-4 através +6) com o início da transcrição em um guanosina essencial um 16. Posições jusante de um pode ser variada o que permite a transcrição de quase qualquer sequência de ARN desejado. Os métodos apresentados para a geração de modelos in vitro run-off de transcrição permitir a síntese in vitro de completos pré-crRNAs que correspondem regiões genômicas CRISPR ou sintéticos pré-crRNA variantes. As transcrições são gerados com um presente trifosfato 5'-terminal, a menos que a reacção de transcrição é iniciada com GMP para se obter 5 'monofosfato de terminais 14. Esses terminais são necessários se as transcrições devem ser rotuladoscom polinucleótido-quinase de T4 e γ-[32 P]-ATP. A actividade de clivagem de Cas6 e Cas6 enzimas semelhantes gera crRNA que contêm 5'-hidroxilo e um grupo 2 ', 3'-terminais cíclicos fosfato. Estes RNAs podem então ser analisados para o reconhecimento pelo complexo de cascata.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer Jeanette Schermuly para a preparação de recombinante RNA polimerase T7 e Ebelt Norman para a assistência na preparação Figura 1. Este trabalho foi financiado por fundos do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) e da Sociedade Max Planck.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |