CRISPR / Cas sistemas median la inmunidad adaptativa en bacterias y arqueas. Muchas proteínas CAS se propone actuar como endoribonucleases que actúan sobre los precursores crRNA de longitud variable. Aquí se ilustran tres enfoques diferentes para generar pre-crRNA sustratos para el análisis bioquímico de la actividad endonucleasa de Cas.
La interacción de los virus y sus anfitriones procarióticos forma a la evolución de la vida bacteriana y Arqueales. Los procariotas desarrollado varias estrategias para evadir los ataques virales que incluyen modificación de la restricción, la infección abortiva y sistemas CRISPR / Cas. Estos sistemas adaptativos inmunes encontradas en muchas bacterias y Archaea consisten de más Abrillantado c r i egularly nterspaced s hort t alindromic r EPEAT (CRISPR) secuencias y un número de C RISPR como asociado (CAS) genes (Fig. 1) 1-3. Los distintos conjuntos de proteínas Cas y repite definir al menos tres grandes tipos divergentes de CRISPR / Cas sistemas 4. Las proteínas universales cas1 y cas2 se proponen para participar en la absorción del ADN viral quegenerará un nuevo elemento separador entre dos repeticiones en el extremo 5 'terminal de un clúster de CRISPR se extiende 5. El clúster completo se transcribe en un precursor-crRNA que contiene todos espaciador y secuencias de repetición y es posteriormente procesada por una enzima de la familia diversa CAS6 en pequeños crRNAs 6-8. Estos crRNAs consisten en la secuencia espaciadora flanqueado por una 5 'terminal (8 nucleótidos) y un 3' terminal de etiqueta derivada de la secuencia de repetición 9. Una infección repetida del virus ahora se puede bloquear como el nuevo crRNA será dirigido por un complejo de proteínas Cas (Cascade) en el ADN viral y lo identifican como tales a través de complementariedad de base 10. Por último, para CRISPR / Cas sistemas de tipo 1, el CAS3 nucleasa va a destruir al invasor detectó DNA 11,12.
Estos procesos definen CRISPR / CAS como un sistema inmune adaptativo de los procariotas y abrió un campo de investigación fascinante para el estudio de las proteínas implicadas Cas.La función de muchas proteínas Cas sigue siendo difícil de alcanzar y las causas de la aparente diversidad de los sistemas CRISPR / Cas aún no se han iluminado. Las actividades potenciales de la mayoría de las proteínas de Cas se predijo a través de detallados análisis computacionales. Una fracción importante de las proteínas Cas son o bien se muestra o propuesto para funcionar como endonucleasas de 4.
A continuación, se presentan los métodos para generar crRNAs y precursor ARNc-para el estudio de endoribonucleases Cas. Diferentes ensayos endonucleasa requieren secuencias de repetición ya sea directamente cortas que pueden ser sintetizados como oligonucleótidos de ARN o secuencias ya crRNA y pre-crRNA que se generan in vitro a través de la ARN polimerasa T7 escorrentía transcripción. Esta metodología permite la incorporación de nucleótidos radiactivos para la generación de sustratos de endonucleasa internos etiquetados y la creación de crRNAs sintéticos o mutante. CAS6 actividad endonucleasa se utiliza para madurar pre-crRNAs en crRNAs con 5'-hydroxilo y un 2 ', 3'-termini cíclicos de fosfato.
Los métodos presentados permiten la generación de Cas sustratos endonucleasas de tamaños diferentes y con mayor o menor libertad en el diseño de la secuencia. El enfoque más directo para la generación de sustratos sintéticos de oligonucleótidos de ARN se limita a diseños de ARN cortos debido a los costes crecientes y las limitaciones técnicas en la creación de más oligómeros de ARN. Si bien el éxito la síntesis de ARN se ha informado de oligómeros de ARN no modificadas de más de 100 nucleótidos de longitud, el máximo práctico y económico para la síntesis de ARN de ratón se encuentra por debajo de 40 nucleótidos. Sin embargo, cualquier secuencia dada se puede sintetizar y la introducción dirigida de nucleótidos modificados (por ejemplo, desoxirribonucleótidos) puede ser utilizada para analizar los sitios de escisión en detalle. Más pre-ARNc debe ser generada a través de la transcripción in vitro.
La hibridación de oligonucleótidos que contienen un promotor de ARN polimerasa de T7 permite la producción de longitud intermedia pre-CRRNComo. La longitud máxima de forma rutinaria y económicamente oligonucleótidos de ADN sintetizados es justo por encima de 150 nucleótidos y representa el máximo de pre-sintéticos crRNAs través de este método. El conjunto de varios pares hibridados de oligonucleótidos de ADN que forman extremos pegajosos con cada otro puede extender esta longitud máxima, pero requiere retos crecientes en la clonación de la construcción. La principal ventaja de este método es la capacidad de generar pre-crRNA construcciones (y por lo tanto Cas endonucleasa de sustratos) con cualquier secuencia deseada. Esto permite que el ensayo de diseños crRNA sintéticos.
Por último, grandes y pre-crRNAs se puede obtener de PCR amplificados de elementos genómicos enteros CRISPR o fracciones de los mismos. Las alteraciones en la transcripción in vitro en plantilla de plásmido puede ser introducido a través de mutagénesis dirigida al sitio para la generación de pre-crRNA variantes. Estas construcciones se pueden utilizar para analizar el patrón global de la escisión endonucleolítica dentro de un enteropre-crRNA.
El trabajo pionero para la producción de ARN no modificado a través de T7 ARN polimerasa en transcripción in vitro se basa en el 14 ARN de transferencia y ARN virus del mosaico del bromo 15. El consenso T7 promotor de ARN polimerasa consiste de un dominio de reconocimiento (-17 a través de -5) y un dominio de iniciación (-4 a través +6) con iniciación de la transcripción en una guanosina esencial +1 16. Aguas abajo de las posiciones +1 puede ser variada que permite la transcripción de casi cualquier secuencia de ARN deseado. Los métodos presentados en las plantillas para generar in vitro de transcripción run-off para permitir la síntesis in vitro de concluir la fase de crRNAs que responden a regiones genómicas CRISPR o sintéticas variantes pre-crRNA. Las transcripciones se generan con un presente trifosfato 5'-terminal a menos que la reacción de transcripción se ceba con GMP para obtener 5 'monofosfato termini 14. Estos terminales son necesarios si las transcripciones deben ser etiquetadoscon polinucleótido quinasa de T4 y γ-[32 P]-ATP. Actividad de escisión de CAS6 y enzimas similares a CAS6 genera crRNA que contienen 5'-hidroxilo y un 2 ', 3'-termini cíclicos de fosfato. Estos ARN se pueden analizar para el reconocimiento por el complejo Cascade.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Jeanette Schermuly para la preparación recombinante de ARN polimerasa T7 y Ebelt Norman para la asistencia en la preparación de la figura 1. Este trabajo fue financiado con fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) y la Sociedad Max Planck.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |