Le vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) definite dal punto di vista biochimico rappresentano un sistema modello conveniente per analizzare le interazioni della famiglia BCL-2, con implicazioni dirette nella migliore comprensione della via mitocondriale dell'apoptosi. Vengono presentati un metodo per la produzione di LUV, insieme a combinazioni standard di proteine della famiglia BCL-2 e controlli per esaminare la permeabilizzazione delle LUV.
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Articolo metodologico
Esaminando BCL-2 Funzione Famiglia con grandi vescicole unilamellari
In questo articolo
Sommario
Abstract
La famiglia BCL-2 (B cell CLL/linfoma) è composta da circa venti proteine che collaborano per mantenere la sopravvivenza cellulare o avviare l'apoptosi1. In seguito a stress cellulare (ad es., danno al DNA), gli effettori pro-apoptotici della famiglia BCL-2, BAK (killer antagonista di BCL-2 1) e/o BAX (proteina associata a BCL-2 di tipo X), vengono attivati e compromettono l'integrità della membrana mitocondriale esterna (OMM), attraverso il processo noto come permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna (MOMP)1. Dopo che si verifica la MOMP, le proteine pro-apoptotiche (ad es., citocromo c) raggiungono il citoplasma, promuovono l'attivazione delle caspasi e l'apoptosi si verifica rapidamente2.
Affinché BAK/BAX inducano la MOMP, è necessario che interagiscano in modo transitorio con membri di un altro sottoinsieme pro-apoptotico della famiglia BCL-2, le proteine contenenti solo il dominio omologo a BCL-2 della regione 3 (BH3-only), come BID (agonista del dominio interagente con BH3)3-6. Le proteine anti-apoptotiche della famiglia BCL-2 (ad es. gene correlato a BCL-2, isoforma lunga, BCL-xL; leucemia mieloide 1, MCL-1) regolano la sopravvivenza cellulare controllando strettamente le interazioni tra BAK/BAX e le proteine BH3-only in grado di attivare direttamente BAK/BAX7,8. Inoltre, la disponibilità delle proteine anti-apoptotiche BCL-2 è regolata anche dalle proteine BH3-only sensibilizzatrici/de-repressori, come BAD (antagonista di BCL-2 della morte cellulare) o PUMA (modulatore dell'apoptosi upregolato da p53), che si legano e inibiscono i membri anti-apoptotici7,9. Poiché la maggior parte del repertorio di proteine anti-apoptotiche BCL-2 è localizzata nella membrana mitocondriale esterna (OMM), la decisione cellulare di mantenere la sopravvivenza o indurre la MOMP è determinata da molteplici interazioni della famiglia BCL-2 a livello di questa membrana.
Vesicole unilamellari grandi (LUV) sono un modello biochimico per esplorare le relazioni tra le interazioni della famiglia BCL-2 e la permeabilizzazione della membrana10. Le LUV sono costituite da lipidi definiti assemblati in rapporti identificati negli studi sulla composizione lipidica di mitocondri di Xenopus estratti con solvente (46,5% fosfatidilcolina, 28,5% fosfatidiletanolammina, 9% fosfatidilinositolo, 9% fosfatidilserina e 7% cardiolipina)10. Questo è un sistema modello conveniente per esplorare direttamente la funzione della famiglia delle proteine BCL-2, poiché le componenti proteiche e lipidiche sono completamente definite e gestibili, cosa che non sempre si verifica con i mitocondri primari. Sebbene il contenuto di cardiolipina non sia solitamente così elevato in tutta la membrana mitocondriale esterna (OMM), questo modello riproduce fedelmente l'OMM favorendo la funzione della famiglia BCL-2. Inoltre, una modifica più recente del protocollo sopra descritto consente analisi cinetiche delle interazioni proteiche e misurazioni in tempo reale della permeabilizzazione della membrana, basate su LUV contenenti un colorante policationico (ANTS: 8-aminonafталene-1,3,6-trisolfonico) e un quencher cationico (DPX: pbromuro di xilene-bis-piridinio11. Man mano che le LUV si permeabilizzano, ANTS e DPX si diffondono separatamente e viene rilevato un aumento della fluorescenza. Di seguito vengono descritte combinazioni comunemente utilizzate di proteine ricombinanti della famiglia BCL-2 e controlli impiegando LUV contenenti ANTS/DPX.
Protocollo
1. Combinare i lipidi e creare un film lipidico
- Operando in una cappa con illuminazione minima, i lipidi solubilizzati in cloroformio vengono combinati in un vial in vetro ambrato da 1,5 ml utilizzando una siringa in vetro ermetica per gas Hamilton risciacquata con cloroformio. Questa miscela produrrà circa 4 mg di lipidi (Figura 1A).
- Cardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- Fosfatidilcolina 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- Fosfatidiletanolammina 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- Fosfatidilinositolo 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl
- Fosfatidilserina 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- Per rimuovere il cloroform....
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Discussione
Il metodo descritto per la generazione di LUV consente un approccio rapido ed efficiente per testare la funzione di diverse proteine della famiglia BCL-2, peptidi e reagenti correlati in un ambiente di membrana biochimicamente definito simile alla MEO. Se si utilizzano valori finali per determinare la permeabilizzazione dei LUV, è possibile preparare diverse piastre per analizzare centinaia di condizioni entro una singola giornata. Riteniamo che i reagenti limitanti in questi saggi siano generalmente la qualità e la quan.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare tutti i membri del Chipuk Laboratory per la loro collaborazione e il sostegno. Inoltre, desideriamo esprimere il nostro apprezzamento a Tomomi Kuwana e Donald Newmeyer per aver sviluppato le basi sperimentali di questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto da: NIH CA157740 (a J.E.C.) e un progetto pilota dell'NIH P20AA017067 (a J.E.C.). Questo lavoro è stato inoltre sostenuto in parte da un contributo per la ricerca 5-FY11-74 della March of Dimes Foundation (a J.E.C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE" | Avanti | 850725C | |
| Fosfatidilcolina L-α (Uovo, Pollo) "PC" | Avanti | 840051C | |
| Fosfatidilinositolo L-α (Fegato, Bovino) "PI" | Avanti | 840042C | |
| Fosfatidilserina L-α (Cervello, Suino) "PS" | Avanti | 8400320 | |
| Cardiolipina (Cuore, Bovino - Sale di Sodio) "CL" | Avanti | 840012C | |
| Set miniestrusore | Avanti | 610023 | |
| Membrana PC 0,2 mM | Avanti | 610006 | |
| Piastra Costar nera a 96 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| BID umano scisso da caspasi-8 | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| BCL-xL umano (senza estremità C-terminale) | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| Peptidi dei domini BH3 di BID/PUMA | Anaspec | 61711/62404 | |
| Lettore microplacche ibrido multicanale Synergy H1 | BioTek | None |
Riferimenti
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E.
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Ristampe e permessi
