Summary
Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf andere
Abstract
Im Zellkern befinden die Proteome, deren Funktionen auf das engste mit der Genregulation verknüpft. Adulten Kardiomyozyten Kerne sind einzigartig wegen des hohen Anteils an zweikerniger Zellen, 1 die überwiegend heterochromatischen Zustand der DNA, und das nicht-teilenden Art der Herzmuskelzellen, die Erwachsenen Kerne macht in einem permanenten Zustand der Interphase. 2 Transkriptionelle Regulation während der Entwicklung und Krankheiten wurden auch in diesem Organ, 3-5 studiert, aber was bleibt relativ unerforscht ist die Rolle der nuklearen Proteine, die für DNA-Verpackung und Ausdruck gespielt, und wie diese Proteine Veränderungen in der transkriptionellen Programme, die während Krankheit auftreten steuern. 6 In den Industrieländern Welt, Herzkrankheiten die häufigste Ursache der Sterblichkeit für Männer und Frauen. 7 Insight, wie nukleare Proteine zusammen, um das Fortschreiten dieser Krankheit zu regeln ist entscheidend für die Förderung der aktuellen Behandlung optionen.
Die Massenspektrometrie ist das ideale Werkzeug für die Bewältigung dieser Fragen, wie es für eine unvoreingenommene Annotation des nuklearen Proteom und relative Quantifizierung ermöglicht, wie die Fülle dieser Proteine verändert sich mit Krankheit. Zwar gibt es mehrere proteomischen Studien für Säugetier nuklearen Proteinkomplexe, 8-13 bis vor kurzem gab es 14 nur eine Studie, die die kardiale nuklearen Proteom, und es als das gesamte Kern, anstatt Erkundung des Proteoms auf der Ebene der Fächer Nuklearteilbild . 15 In einem großen Teil ist dies Mangel an Arbeit wegen der Schwierigkeit der Isolierung Herz Kerne. Cardiac Kerne treten innerhalb einer starren und dichten Aktin-Myosin Vorrichtung, an die sie über mehrere Erweiterungen aus dem endoplasmatischen Retikulum verbunden sind, in dem Umfang, Myozyten Kontraktion verändert ihre Gesamtform. 16 Zusätzlich Kardiomyozyten 40% Mitochondrien Vol. 17, die necessitätes Anreicherung des Kernes von den anderen Organellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für kardiale Urananreicherung und weitere Fraktionierung in biologisch relevanten Fächern. Darüber hinaus haben wir detailliert Verfahren zur markierungsfreien quantitativen massenspektrometrischen Dissektion dieser Fraktionen-Techniken zugänglich in vivo Experimente in verschiedenen Tiermodellen und Organsysteme, wo metabolische Markierung nicht durchführbar ist.
Protocol
Die experimentelle Workflow enthält sieben großen Schritten (Abbildung 1). Bei allen Arbeiten, Proben, die auf dem Massenspektrometer laufen soll, sollte der Experimentator tragen Laborkittel, Handschuhe und Haarnetz und kümmern uns um Verunreinigung durch Staub und persönliche Abbau von Keratin zu vermeiden.
Ein. Herz Homogenisierung und Reaktorsicherheit Isolation
Mäuseherzen werden homogenisiert und eine intakte Nuklei isoliert Pellet wird (Abbildung 2).
- Sacrifice erwachsenen Maus, Verbrauchssteuern das Herz gründlich in eiskaltem PBS, und homogenisieren auf Eis in Glas Dounce (wir bevorzugen die Wheaton Tissue Grinder von Fisher, # 08-414-13A, sondern auch andere Methoden können genauso gut funktionieren) mit 2 ml Lysepuffer (eine hypotonische Lösung, die differentiell lysiert die Zellmembran in den Organellen einschließlich Kern) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl und 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] in entionisiertem Wasser plus Protease und Phosphatase inhibitor Mischung: 10 mM Natrium-Butyrat, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0,1 mM NaF und 1 Roche Protease pellet/10 ml - Lysepuffer kann gelagert werden bis zu einer Woche bei -20 ° C ). (Anmerkung: Wir finden es nicht notwendig, die Herzen mit PBS perfundieren, wie unsere massenspektrometrischen Daten und GO-Analyse identifizieren die Proteine als überwiegend Kardiomyozyten [p-Wert 3.8E-22] in Ursprungslandes nach Kontamination mit Blut Gegensatz [p-Wert 5,0 E-2].)
- Gießen durch 100 um Sieb Lysat und sammeln Durchströmung in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. An diesem Punkt, wenn nicht anders angegeben, sollte Probe auf Eis aufbewahrt.
- Zentrifuge bei 4.000 rpm für 5 min bei 4 ° C.
- Überstand entfernen. (Dies ist das Cytosol und sollte bei -80 ° C gelagert werden Es enthält die lysierten Mitochondrien.) Pellet in 200 ul Lysepuffer durch Verreiben. (Dies ist die rohe Kernpellet.)
- Füllen Sie 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Saccharose Buffer (24% Saccharose Gewicht / Volumen, 10 mM Tris pH 7,5 und 15 mM NaCl in entionisiertem Wasser mit Protease / Phosphatase Inhibitormischung - Saccharose Puffer sollte frisch hergestellt werden am Tag der Verwendung). Gently Schicht des resuspendierten Pellets auf der Oberseite des Saccharose-Pad und Zentrifuge bei 5.000 rpm für 10 min bei 4 ° C.
- Entfernen des dünnen Films auf die Oberseite als auch die Saccharose-Pad (welche Membran). Spülen Sie das verbleibende Pellet mit 200 ul eiskaltem PBS / EDTA (1x PBS mit 1 mM EDTA). (Dies ist die Kerne Pellet und können solubilisiert oder zur Verwendung in Western Blot oder Elektronenmikroskopie fixiert werden [siehe Schritte 4.1 und 4.2] zur Anreicherung quantifizieren.)
2. Nukleoplasma und Waschmittel extrahiert Chromatin Fraktionierung
Das Rohprodukt Kerne Pellet wird in einen Kernplasma und Waschmittel nachextrahiert Chromatin Fraktion getrennt wird, die Proteine mit der DNA lose verbunden.
- Verreiben Pellet aus Schritt 1,6 in 200 ul Detergenzextraktion Puffer (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl 2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M Harnstoff, 1% NP-40 in deionisiertem Wasser mit Protease / Phosphatase-Inhibitors Mischung - Detergenzextraktion Puffer gelagert werden bis zu einer Woche bei -20 ° C).
- Vortex Probe 2 mal 10 sec jeder. Auf Eis 10 min.
- Zentrifugieren bei 13.000 UpM für 5 min bei 4 ° C.
- Überstand entfernen. (Dies ist die Nukleoplasma und sollte bei -80 ° C gelagert werden). Spülen Pellet mit eiskaltem PBS / EDTA. (Dies ist die Chromatin Pellet.)
- Verreiben Pellet in 300 ul Tris, SDS, EDTA-Puffer (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS in deionisiertes Wasser mit Protease / Phosphatase Inhibitormischung - Tris, SDS, EDTA Puffer kann gehalten werden bis zu einer Woche bei -20 ° C).
- Beschallen 3-6 mal für 10 sec jeden zu brechen DNA. Halten Probe auf Eis zwischen sonications.
- Zentrifugieren bei 13.000 UpM für 5 min bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand. (Überstand wird das Waschmittel-extrahierten Chromatin-Protein fraction und sollte bei -80 ° C) gehalten werden. Das verbleibende Pellet sollte klein und kann verworfen werden.
- Bei der Verwendung von isolierten Myozyten anstelle von ganzen Herzen: Isolieren von neugeborenen Ratten ventrikulären Myozyten aus Rattenjungen 1 Tag nach der Geburt durch enzymatische Verdauung, durch die Kultur in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Insulins -Transferrin-Natriumselenit (ITS), und 1% Penicillin. Nach 24 Stunden, um Serum-freie Medien (wie oben, aber ohne FBS) zu übertragen. Ernten Sie die Zellen in Lysepuffer (aufgeführt in 1,1), und beginnen nuklearen Fraktionierung in Schritt 1.3.
3. Acid-Extraktionsfraktionierung - DNA-gebundenen Protein Enrichment
Ein separates Fraktionierung für Proteine bereichert dicht an die DNA gebunden ist, einschließlich Histone.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,1-2,4.
- Verreiben das Chromatin Pellet in 400 ul 0,4 N Schwefelsäure. Vortex, um Klumpen zu entfernen.
- Inkubieren bei 4 ° C für 30 min oder overnight beim Drehen.
- Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C bis nuklearen Trümmer zu entfernen.
- Überstand in ein frisches Röhrchen.
- Fügen Sie 132 ul von Trichloressigsäure zu dem Überstand tropfenweise. Invert mehrmals. Inkubieren auf Eis für 30 min.
- Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C.
- Überstand verwerfen. Vorsichtig spülen Pellet mit eiskaltem Aceton. (Dies ist die Histon-Pellet.)
- Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C.
- Wiederholen Sie waschen, Schritte 3,8-3,9.
- Air-dry Pellet.
- Das Pellet in 100 ul Tris, SDS, EDTA-Puffer. PH eingestellt auf 8 durch Zugabe von 1 M Tris. (Verwenden Sie eine 1 M Tris Lager, das nicht pH-adjusted).
- Beschallen im Wasserbad für 15 min. Verhindern, indem Eis Wasserbad Überhitzung. (Dies ist die Säure extrahierten Fraktion und sollte bei -80 ° C gelagert werden)
4. Reinheit prüfen
Western-Blots und Elektronenmikroskopiebestätigen erfolgreiche Anreicherung von Keimen und Erschöpfung der anderen Organellen. Um typische Ergebnisse für alle der folgenden Qualitätskontrolle Tests sehen, finden Sie in unserem früheren Veröffentlichung. 18
- Western Blot-Analyse durchzuführen. Sonde enthaltende Membran für jede Fraktion Histon H2A oder nucleoporin p62 (als Marker zur nuklearen Anreicherung verifizieren) und zum Adeninnucleotid Transporter, BiP und Tubulin (als mitochondriale Marker, endoplasmatisches Retikulum Marker und Zytoskelett-Marker jeweils an Reinheit verifizieren). Um eine erfolgreiche Subfraktionierung der Kerne, Sonde für Histon H3 oder Fibrillarin (Reiniger und Säure extrahierten Chromatin und intakten Zellkernen) und SNRP70 oder E2F (Nukleoplasma) zu überprüfen. Sonde für Retinoblastom oder Hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (angereichert in Waschmittelqualität extrahiert Chromatin über Säure extrahierten Fraktion). Zusätzliche Kontrollproben von HeLa Zelllysat und ganzen Herzen Lysat kann auch in demselben Gel ausgeführt werden: Planen HeLa Zelllysat durch Zugabe von Tris-Steuerung, SDS, EDTA Puffer Kulturschale und unter Verwendung eines Zellenabstreifers zu Probe zu sammeln. Beschallen und zentrifugieren Probe in Schritten von 2,6 bis 2,7. Planen ganze Herz Lysat Steuerung durch Homogenisieren des Herzens in 2 ml Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Glycerophosphat in deionisiertem Wasser mit Protease-und Phosphatase-Inhibitor-Mischung). Beschallen und zentrifugieren wie in den Schritten 2,6-2,7. Siehe Schritt 5 zur Herstellung von Protein-Proben für SDS-PAGE.
- Electron Microscopy: Resuspendieren des Pellets aus Schritt Kerne 1.6 in Lysepuffer, enthaltend 2% Glutaraldehyd und fixieren Probe bei 4 ° C. Spülen Proben in Osmiumsäure, dehydrieren und betten in Epoxidharz. 70 nm Scheiben geschnitten unter Verwendung eines Reichert Ultracut Ultramikrotom. Stain Proben in Uranylacetat und dann Blei und Bild mit einem JEOL 100CX Transmission Electron Microscope. Quantifizieren Anreicherung durch Messen der Fläche intakter Kerne gegenüber Gesamtfläche von Material abzubildenden. Wir finden 60-80% der Kerneintakt sein. 14
Wichtige Überlegungen zur Anreicherung gegenüber Reinigen Kernen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Proteomanalysen kardialer Chromatin für die Zwecke des Studiums globalen Genregulation Prozesse während Krankheit ermöglichen. Ein wesentlicher Bestandteil der Gestaltung ganzen Proteoms massenspektrometrischen Untersuchungen ist die Frage der Dynamik und in der Lage zu identifizieren und zu charakterisieren low-Fülle Proteine. Neben dem primären Ziel der Bereitstellung von Informationen über nukleare und Chromatin-spezifische Biologie, bereichernd für die nukleare Proteom, erhöht die Wahrscheinlichkeit von Erfassung dieser low-Fülle Proteine, ebenso wie weitere Subfraktionierung der Kerne. Jedoch, wie diskutiert, weist der erwachsenen Kardiomyozyten eine dichte Zytoskelett-Komponente, die an der Kernmembran. Wir glauben nicht, dass wir komplett gereinigt, die Kerne von diesen anderen Zellbestandteilen. Jedoch durch Anreichern nur für die Kerne haben wir erhaltened ein akzeptabler Schwellenwert, um die Arten von Analysen zu ermöglichen beschrieben.
Insbesondere haben wir EM verwendet, um die Reinheit der rohen Kerne Pellet gefunden beurteilen und 60-80% der Fraktion an intakte Zellkerne, etwa 10% Mitochondrien, und der Rest Verunreinigungen sein. Außerdem wissen wir aus unseren früheren Studie über die intakten Zellkernen Bevölkerung, dass zwar viele Myofilamente werden nicht durch dieses Protokoll (einschließlich Tubulin und Aktin wie durch Western gemessen) bestimmter Proteine (Calsarcin-1) angereichert sind, was auf eine wahre biologische Bevölkerung bereichert diese Proteine im kardialen Kernen. 19
Zusätzlich verglichen wir die Proteine wir gefunden, dass die in der Säure extrahierten Chromatin Fraktion, um den vorhergesagten Rollen dieser Proteine durch Gen Ontologie. Wichtig ist, dass diese Gene Ontology Analyse nicht berücksichtigt die relative Häufigkeit der verschiedenen Proteine (wie unser Western-Blot-Daten) zu nehmen, sondern zählt alle Proteine identifiziert (zu bereicherned oder nicht) als gleich, wenn sie gemeinsame Wege und zellulären Kompartimenten. Analyse dieser Signalwege und zellulären Kompartimenten in unserer früheren Veröffentlichungen gefunden werden. 18,20 Am wichtigsten ist, erlaubt der Erfolg der Anreicherung im Chromatin Säure extrahierten Fraktion uns, um die Anwesenheit von 54 Histon Varianten in der erwachsenen Maus Myozyten, 18 identifizieren von denen viele stützte sich auf ein einzigartiges Peptid zur Identifikation und damit wahrscheinlich wurden nicht nachweisbar, ohne diese Anreicherung Protokoll die enorme Komplexität des gesamten Kardiomyozyten Proteom gegeben. Der Proteine 1048 wir von der kardialen Kerne identifiziert waren 56 von ihnen (5,3%) kommentiert von GO-Analyse, einen Teil der Nukleosomkonzentration (eine Komponente des Kerns von Interesse) sein. Eine andere Studie Betrachtung des gesamten Herzens identifizierten 6180 Proteine, von denen nur 11-Proteine (0,18%) annotiert, einen Teil der Nukleosomkonzentration 21 sein sollten. Dies veranschaulicht die Stärke unseres Protokoll meaningfully bereichern für nukleare Proteine.
5. Protein Gel und enzymatische Protein Digest
Proteine werden durch eindimensionale SDS-PAGE und Trypsin verdaut, um das Massenspektrometer ausgeführt werden getrennt.
- Proben auf Eis auftauen und bestimmt Proteinkonzentration für jede Probe unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassay.
- Verdünnen Sie die Proben mit einer bekannten Konzentration mit 5x Laemmli-Puffer, kochen für 10 min und bei -20 ° C für eindimensionale SDS-PAGE. Verdünnen Sie die Proben auf eine bekannte Konzentration unter Verwendung von Harnstoff Extraktionspuffer und bei -20 ° C für zweidimensionale Gele.
- Ausführen der Wahl Gel geladen gleiche Menge an Protein in jeder Spur. Protein kann auf eine Nitrozellulosemembran für Western-Blotting (mit Bedienelementen wie in Schritt 4.1) oder Bänder können für die Massenspektrometrie-Analyse verwendet werden geschnitten werden übertragen werden, siehe folgenden Schritte.
- Entfernen Gel aus der Vorrichtung unter Verwendung von entionisiertem Wasser, um es in einen sauberen Behälter übertragen.Titelbild Gel in Oriole Flecken und Umhüllungsbehälter in Alufolie um Licht zu blockieren. Lassen Gel bei Raumtemperatur auf einem Schüttler für mindestens 90 min inkubieren.
- Bild Oriole-gefärbten Gel (Abbildung 3) mit UV-Licht, und markieren, wo Bands auf das Bild geschnitten wird. Wir schneiden jede Spur in etwa 25 2-mm Bänder für Studien Messen des gesamten Proteoms.
- Zeigen Gel auf eine saubere Oberfläche. Verwenden Sie nur Materialien, die gehalten wurden versiegelt oder mit Ethanol besprüht, um Keratin Kontamination zu verhindern. Schneiden Sie jede Band, und dann weiter schneiden sie in 3 gleich große Stücke. Legen Sie alle drei Stücke von jedem Band zusammen in eine eigene Bezeichnung 1,5-ml-Tube. Gel-Stücke können bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden.
- Bereiten Sie gel-Stecker für die enzymatische Verdauung. Ausgewählte Gelstücke mit Trypsin bei 37 ° C über Nacht. Für detaillierte Gelprobe-Protokoll finden Sie auf unserer früheren Veröffentlichung. 22 Sie können niedermolekulare Bands mit Chymotrypsin anstelle von Trypsin zu verdauen,zu Trypsin das umfangreiche Spaltung von Histon beseitigen.
6. Massenspektrometrie und Datenanalyse
Proben werden auf einem LC-getrennt und analysiert mittels MS / MS. Die Spektren sind gegen ein Protein Datenbank für Proteinidentifizierung gesucht.
- Führen Sie 10 ul jeder Probe durch LC / MS / MS. Wir verwenden eine nano-flow Eskigent LC mit einer 75 um Umkehrphasensäule. Verwenden eines LC Lauf für eine Reihe von Proteinen und Peptiden optimiert. Verwenden Sie ein linearer Gradient von Laufmittel A (0,1% Ameisensäure, 2% Acetonitril [ACN] in Wasser), um mobile Phase B (0,1% Ameisensäure, 20% Wasser in ACN): 60 min von 5% mobile Phase B auf 50 % B, dann 15 min von 50% B bis 95% B und schließlich 10 min bei konstanten 95% B. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 200 nl / min. Erwerben Massenspektrometrie Daten in einer datenabhängigen Modus. Wir verwenden ein Thermo Orbitrap, die die oberen 6 häufigste Stammionen Fragmente.
- Wiederholen Sie läuft mindestens drei biologische und zwei technische repliziert. (RMPFOHLENE)
- Verwenden Sie Software (kommerziell verfügbaren Optionen gehören BioWorks und Xcalibur;! Öffentlich verfügbaren Optionen gehören PROWL, X Tandem, SpectraST) Spektren gegen die UniProt Datenbank Ihrer Wahl suchen über einen Suchalgorithmus (wie SEQUEST oder MASCOT).
- Betrachten Änderung Suchparameter für Cystein Carbamidomethylierung und Methioninoxidation, zwei gemeinsame Änderungen während der Probe Verarbeitung entstehende ermöglichen.
- Berechnen eines falsch-positiven Rate mit umgekehrter Datenbanksuche.
- Filtern Protein Identifikationen zu akzeptieren nur Spiele der Schwelle Vertrauen. Wir empfehlen die folgenden Parameter für den Anfang: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (4); deltaCN> 0,1, Konsens-Score ≥ 20, Masse Toleranz 2 Da für Stammions, Masse Toleranz Da von 0,5 für das Produkt-Ionen, mindestens 2 einzigartigen Peptide pro Protein und nicht mehr als 3 Spaltungen verpasst.
7. Label-freie Quantifizierung
Determine der relativen Häufigkeit von Proteinen unter Verwendung von markierungsfreien Quantifizierung (Abbildung 4).
- Eine Reihe von Software-Programmen sind öffentlich oder kommerziell erhältlich für Label-free Quantifizierung der Massenspektrometrie Daten einschließlich Census (Prof. Yates 'Gruppe), 23 Elucidator (Microsoft), 24 SIEVE (Thermo Scientific), 25 Scaffold (Proteome Software). 26 Diese Programme zielen auf die massenspektrometrische Signal intakten Peptiden oder der Anzahl der Peptidsequenzierung Veranstaltungen mit relativen Proteinmengen zwischen zwei oder mehr Staaten korrelieren.
- Während jedes Programm umfasst eine ähnliche Analyse Pipeline sind einige Programme auf die Arten der speziellen Analyse, die an den Daten durchgeführt werden kann, begrenzt. Anfänglich Daten aus verschiedenen Läufen ausgerichtet ist, wird Signalintensität normalisiert und Peptidpeaks sind für die Analyse ausgewählt.
- Die beiden häufigsten Methoden sind die Quantifizierung auf die spektrale Zählen oder LC-MS Peakfläche basiert. FülleRatio wird, um Änderungen in der Peptid Abundanz zwischen verschiedenen Gruppen zu bestimmen.
- Diese Programme können mit Proteomik Suchalgorithmen (Mascot, Sequest, X! Tandem) Schnittstelle zur Quantifizierung Informationen Proteinidentifizierung korrelieren.
- Um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten ist es wichtig, sowohl biologische (verschiedene experimentellen Proben) und technische (mit dem gleichen Probe auf dem Massenspektrometer mehrfach) beinhalten Wiederholungen von Massenspektrometrie-Daten.
- Variation Peptid Abundanz in und zwischen experimentellen Bedingungen kann durch ANOVA beurteilt und aufgetragen über PCA (Abbildung 5).
Wichtige Überlegungen für Label-free Quantifizierung. Beim Durchführen Label-free Quantifizierung, muss besondere Aufmerksamkeit gewidmet, um konsistente Probenvorbereitung, Verdauung Zeit und LC-MS/MS Bedingungen zu gewährleisten, da jede Probe muss verarbeitet und analysiert werden getrennt. Im Gegensatz zu metabolic Kennzeichnung Ansätze, Vergleiche in Label-freie Experimente basieren auf Daten aus unterschiedlichen Massenspektrometrie läuft aus (weil der Mangel an Kennzeichnung entfällt die Möglichkeit der Durchführung zusammen), wodurch erfordern eine hohe Reproduzierbarkeit in allen Aspekten der Analyse von Proben (dh der Probenvorbereitung, LC-und MS-Schritte) und die Verwendung von hohen Massengenauigkeit Massenspektrometer.
Um geringfügige Änderungen in Probenvorbereitung und Analytik ein bekannter Standard ausmachen kann zu jeder Probe hinzugefügt werden, um in der Normalisierung der Daten unterstützen. Zusätzlich erlauben die meisten Softwareprogramme Normalisierung der Signalintensitäten (zB durch Einstellen auf Hintergrundrauschen oder einer bekannten reichlich Analyt) nach der Datenaufnahme um Unterschiede in Injektion, Ionisierung und Fragmentierung. Ausrichten Algorithmen existieren in den meisten der oben genannten Programme, die bei der Korrektur von Unterschieden in der Peptid-Elutionsprofile unterstützen. Der Einsatz von biologischen und technischen repliziert ist EssenTiAl in dieser Art von Studie, wie es statistische Analysen, um die Reproduzierbarkeit und Konsistenz aller beobachteten Veränderungen in Proteinmenge bestätigen können.
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Representative Results
Abbildung 4 verdeutlicht den Nutzen dieser Form der relativen Quantifizierung. Gezeigt im linken Fenster sind die einzelnen monoisotopic Peptidpeaks (überlagert von verschiedenen Mäusen), die als Angehörige der Protein HMGB1 (identifiziert über Datenbanksuche) bezeichnet wurden. Jeder Peak, im Wesentlichen eine extrahierte Ionenchromatographen für die gegebene Peptid, kommt aus einer anderen Maus. Die Gruppen repräsentieren drei verschiedene physiologische Zustände: basal, Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz, mit drei biologischen Wiederholungen für jede Gruppe. Durch Integrieren der Fläche unter der Kurve kann eine relative Häufigkeit berechnet. Im mittleren Bereich der Durchschnitt dieser Häufigkeiten dargestellt. Wie sich aus dieser Art der Analyse, dass die Fülle des HMGB1 Proteins im Verlauf der Krankheit verändern. Im Gegensatz dazu zeigen die Bodenplatten am Beispiel von Histon H4, die nicht mit der Krankheit ändert. In beiden Fällen kommen Peptide von Tieren derselben phenotypic Zustand zeigen ähnliche Elutionsprofile und die relative Häufigkeit, was die Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung und LC / MS / MS.
Die Reproduzierbarkeit dieser Technik wird weiter bestätigt mit Hauptkomponentenanalyse (PCA). Wie in 5 gezeigt, zeigt Anwendung ANOVA auf die gesamten Proteom Ergebnisse jedes Tier eine eindeutige Clustering durch kardiale Phänotyp (biologische Replikate) mit dem engsten Assoziation zwischen technischen repliziert (unterschiedliche Massenspektrometrie läuft der gleichen Probe) von demselben Tier . Dies bietet Sicherheit, dass die Fülle Veränderungen für einzelne Proteine von Interesse tatsächlich beobachtet der auf die Differenz im physiologischen Zustand.
Von gleicher Bedeutung wie die Quantifizierung und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist die erhöhte Abdeckung des nuklearen Proteom durch nukleare Subfraktionierung aktiviert. Abbildung 6 zeigt, dass die Analyse der der ganze Kern allein nicht, obwohl aufdecken eine Mehrzahl der nuklearen Proteine identifiziert, wenn die Kombination aus den einzelnen Analysen getrennten Abteilen (1.048 eindeutige Proteine in Summe über den Fraktionen 428 ermittelten gegenüber von der intakten Zellkerne identifiziert). Darüber hinaus zeigt die moderate Überschneidungen zwischen den verschiedenen Fraktionen die biologische Relevanz der Berücksichtigung dieser Fächer individuell hinzugefügt Einblick in nuklearen Funktion und Genregulation. Schließlich ist die Fähigkeit, spezifisch fraktionieren sauer extrahiert oder Chromatin reichert Chromatin für wichtige strukturelle Proteine, wie Histone Detergenz extrahiert, wodurch fokussierter massenspektrometrischen Analysen (wie solche, die auf post-translationale Modifikationen) auf einer Gruppe von Proteinen, ohne erfordern spezifische Antikörper für jede Variante und Isoform.
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Abbildung 1. Ablaufschema für die Charakterisierung von Proteinen in der Herz-Atom-U-Fächern. Whole Mäuseherzen homogenisiert und das Lysat für Kerne bereichert. Kerne sind fraktioniert in Nukleoplasma, Waschmittel-extrahierten Chromatin und Säure extrahierten Chromatin Fraktionen. Proteine aus jeweils isoliert und durch eindimensionale SDS-PAGE, und die Banden Trypsin verdaut und mittels LC / MS / MS ausgeführt. Nach Recherche in Datenbanken, ist Label-free Quantifizierung verwendet, Fülle Trends für Proteine in den verschiedenen Fraktionen zu identifizieren.
Abbildung 2. Nuclear Fraktionierung schematisch. Kerne sind von ganzem Herzen Homogenat über einen Saccharose-Gradienten angereichert. Jeder Kerne Probe kann entweder in Nukleoplasma und Waschmittel-extrahierten Fraktionen oder in eine Wechselspannung getrennt werdenid-extrahierten Fraktion, die eine Bereicherung für die Histone.
Abbildung 3. Eindimensionale Gel der verschiedenen Fraktionen. 20 ug ganzem Herzen Lysat (WHL), intakten Zellkernen (Nuc), Zellkern (NUP), Chromatin (DE) und Säure extrahierten Chromatin (AE)-Fraktion aus Mäuseherzens Reinigungsmittel extrahiert wurden auf einer eindimensionalen SDS-PAGE-Gel (12% Acrylamid) zusammen mit Säure extrahierten Chromatin-Fraktion aus HeLa-Zellen laufen und gefärbt mit Oriole. Die unterschiedliche Musterung der Abundanz des Gesamtproteins auf den verschiedenen Molekulargewichten zeugen von einzigartigen Proteomen für die verschiedenen Sub Abteile, einschließlich Anreicherung für die niedermolekularen Histone im Waschmittel-extrahierten Chromatin an der in den Säure extrahierten Fraktionen angereichert . Bemerkenswert ist auch die im wesentlichen weniger komplexe Natur des AE-Fraktion aus HeLa-Zellens als derjenigen aus dem Herzen gegenüber.
Abbildung 4. Relative Häufigkeit Quantifizierung Mäuse aus drei verschiedenen kardialen heißt es:. Basalen (blau) Hypertrophie (rot) und Störung (grün) wurden in dreifacher gesammelt und deren Protein-Proben liefen in zwei technische Replikate von LC / MS / MS. Dargestellt auf der linken Seite sind die monoisotopic Peaks für ein spezifisches Peptid (deren Spektren wird auf der rechten Seite dargestellt). Relative Häufigkeit wurde durch Integration berechnet und gemittelt zwischen Wiederholungen jeder phänotypischen Zustand (Mitte), um die relative Häufigkeit des Peptids (und das Protein, von dem es kam) bei den unterschiedlichen Zuständen der Herzinsuffizienz vergleichen. Das obere Bild zeigt ein Peptid aus HMGB1, dessen Abundanz in der Krankheit verändert, während die Bodenplatte (Histone H4) nicht ändert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 5. Hauptkomponentenanalyse zeigt Reproduzierbarkeit. ANOVA-Analyse für jede Maus (3 biologischen Replikaten / kardiale Zustand x 2 technische Replikate) für Peptid-Intensität (Achsen) aufgetragen zeigt Clustering durch Krankheit Zustand (basal in blau, Hypertrophie in Rot, Scheitern in grün), die zeigt die erfolgreiche Reproduzierbarkeit der Massenspektrometrie Daten und signifikante physiologische Unterschiede zwischen den verschiedenen Krankheitsstadien.
Abbildung 6. Globale Charakterisierung von verschiedenen Atom-U-Fächer. Wir identifizierten 1.048 Summe Proteine in allen 4 frAktionen. 146 Proteine wurden von allen vier Fraktionen geteilt wird, im Vergleich zu 749-Proteine im Zellkern identifiziert, 380 in der Wasch-extrahierten Chromatin Fraktion, 426 in der Säure extrahierten Chromatin Fraktion und 428 in den intakten Zellkerne. Das Venn-Diagramm zeigt die Überlappung in mäßiger identifizierten Proteine zwischen den Fraktionen, Hervorhebung der Existenz von unterschiedlichen Regionen in vivo und die Fähigkeit dieses Fraktionierung zu isolieren. Darüber hinaus rechtfertigt die deutlich unvollständige Charakterisierung des gesamten nuklearen Proteom erreichbaren nur analysieren unfraktioniertem Kerne (orange) weitere Fraktionierung.
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Discussion
Zwei Hauptverfahren für nukleare Isolierung wurden zuvor bewertet: 27 eine ist die Technik der Behrens Homogenisieren lyophilisierten Gewebe in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel und das zweite, eine Modifikation der wir hier von Homogenisier Gewebe in einer wäßrigen Saccharose / Salzlösung gefolgt durch differentielle oder Dichtegradientenzentrifugation.
Subfraktionierung der Kerne durch saure Extraktion von Gewebeproben ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung Chromatin, die seit 1960, 28 wurde mit dem ursprünglichen Ziel darin besteht, Histone analysieren. Säure-Extraktion Protokolle wurden für dieses Ziel zur Reinigung Kern nukleosomalen Histone Komponenten entwickelt 29 Eine Einschränkung dieser früheren Studien ein Fehlen von Informationen über die Nicht-Histon-Proteine bilden, und Modifizieren, Chromatin. Haben wir diese Aufgabe mit dem aktuellen Protokoll gerichtet zur Charakterisierung unterschiedliche biologische Unterfraktionen des Kerns und Chromatin.Dieser Ansatz, der Detergenzextraktion oder saure Extraktion von Chromatin nutzt parallel, zeigt die Vielfalt der Chromatin regulatorische Moleküle und unterscheidet zwischen den Ebenen der endogenen Regulation, wodurch sie als eine robuste Ansatz für Hypothese Generation.
Die Anwendung der etablierten Säure-Extraktion Methodik der Erwachsenenbildung Myozyten stellt bestimmte Hindernisse einschließlich der dichten Zytoskeletts und großen mitochondrialen Bevölkerung. Während Versionen von Säure-Extraktion an ganzen Herzgewebe 30 verwendet wurden die Experimente wurden gezielt untersuchen zu bekannten Proteinen durchgeführt, die aktuelle Protokoll ist so konstruiert und ausgeführt wurde um unverzerrte Proteomanalyse aktivieren. Darüber hinaus fanden wir es sinnvoll, zu prüfen, das Waschmittel-extrahiert und durch Säure extrahierten Chromatin getrennt (nur 37% Überlappung wurde zwischen den Proteome von diesen beiden Fraktionen beobachtet) zum besseren Verständnis der Dynamik, durch die diese Populationen von Chromatin-Proteine interact mit DNA. Andere Protokolle unter Verwendung von Harnstoff-basierte Puffer wurden ebenfalls beschrieben, 31,32, die vor der Säureextraktion durchgeführt, bereichern Proteinen weniger fest an dem Genom gebunden. Zusätzlich zu Chromatin Fraktionen, andere haben subfraktioniert den Kern, um die Nukleolus isolieren, 33 aber Subfraktionierung für massenspektrometrische Analyse der myokardialen Kerne von ganzem Herzen isoliert wurde nicht berichtet.
Shotgun Proteom Studien an intakten Kernen, dh unfraktioniertem Organellen-wurden auf Herzmuskelgewebe mit einem MudPIT Ansatz durchgeführt. 15 Diese Studie identifizierte 1.044 nuklearen kardiale Proteine, auf dem gleichen Maßstab wie unser Protokoll, aber sie verlassen sich mit einem Durchschnitt von 8,5 repliziert, bei jedem Durchlauf dauert 20 Stunden mit niedrigem Fülle Proteine nachzuweisen. Im Gegensatz dazu beschäftigten wir Subfraktionierung, sowohl die Zahl der identifizierbaren Proteine (ohne langwierige Chromatographie-our LC Pisten sind 85 min), während importantly bietet auch zusätzliche biologische Informationen über den sub-nukleare Lokalisation und die relative Häufigkeit der Proteine.
Aus einer ganzen Mäuseherzens (etwa 0,14 g) gewinnen wir ungefähr 1,2 mg (0,85% der Gesamtmenge) von Protein im intakten Zellkerne. Von der intakten Zellkerne erreichen wir die folgende Wiederherstellung für jede der Unterfraktionen (Anmerkung: die Gesamtwerte 100% übersteigen als Säure-Extraktion und Detergens-Extraktion auf separaten Herzen, nicht in Reihe durchgeführt): Kernplasma (15%), Waschmittel- extrahiert Chromatin (85%) und Säure extrahierten Chromatin (54%). Im Vergleich dazu hat ein Kit Thermo Scientific (NE-PER Kern-und Zytoplasma Reagenzien), die ihre Datenblatt sagt Ausbeuten cytosolischen Protein 1,6 mg und 0,6 mg Kernprotein (1,5%) 40 mg Mäuseherzens mit einer 10% Kreuzkontamination zwischen die beiden Fraktionen. Sigma hat ein Kit (NXTRACT, CellLytic Nuclear Extraction Kit), die sie auf Kaninchenmuskel getestet haben, aber nicht Herz und erholte sich von 100 mg Gewebe 0,46 mg Kernprotein (0,46%), was sie bezeichnen ihre "crude Kernpellet" mit einem "wenige Prozent" der zytoplasmatischen Kontamination. Andere Unternehmen, wie Epigentek bieten auch Kits, aber wir waren nicht in der Lage, spezifische Details auf die Anreicherung und Reinheit auf ihren Websites zum Vergleich finden.
Wir haben eine neue Technik beschrieben, um Adressen den aktuellen Bedarf an erfolgreiche Anreicherung von kardialen Keime für proteomischen Studien. Wir beschreiben außerdem Methoden zur Sub Abteil Fraktionierung, die sowohl erhöht die Fähigkeit, weniger reichlich Proteine sowie für höhere Auflösung ermöglicht, Quantifizierung und Bestimmung von Protein-Lokalisierung detektieren. Zu diesem Zweck bietet das Protokoll für die Massenspektrometrie-Analyse empfohlenen Richtlinien jedoch von Fall zu Fall Überlegungen wahrscheinlich nötig sein wird. Zum Beispiel fanden wir, dass die große Zahl von Herz-Histon-Variante Isoformen mit Sequenzähnlichkeit benötigt manuelle Inspektion der Spektren zu ma zuweisenjor Gipfeln und bestätigen Stammions Masse vor in der Lage, sicher zuordnen Spektren. 14 Suchparameter kann auch für post-translationale Modifikationen (PTM) Identifizierung und hervorragende Kritiken angepasst werden gibt detailliert Methoden und Anliegen mit Daten Interpretation für PTM-Analyse (einschließlich PTM Bereicherung , 34 Software für PTMs, 35 Analyse von kombinatorischen PTMs, 36 alternative Fragmentierung Strategien 37 und alternative Verdauung und Verarbeitung 38,39).
Die Anreicherung und Fraktionierung beschrieben ist vom ganzen Herzen (was 50-70% Kardiomyozyten Masse). Während diese Opfer Aspekte der Zell-Spezifität, die kann besonders wichtig sein für bestimmte Familien von nuklearen Proteinen, ermöglicht sie eine sehr viel schnellere Aussetzung der Proteine in die richtige Puffer, die nicht mit erwachsenen Myozyten Zellisolation Protokolle möglich. Auf diese Weise diese Methodik besser bewahrt die Integrität of die Probe gegen den Abbau. Aber auch beschrieben werden, sind Anweisungen für die Anwendung dieses Protokolls auf isolierte neugeborenen Ratten ventrikulären Myozyten, da beide isolierte Zellen und ganze Organismen Modellen notwendigen Werkzeuge für das Studium Herzinsuffizienz sind. Im Prinzip könnte diese Methode auch für erwachsene Myozyten durch das Enzym die Verdauung von isolierten Herzen-mit dem Vorbehalt, dass Änderungen im Protein-Bindung, die bei der Isolierung (die über eine Stunde dauern) auftreten Interpretation der Proteomik Beobachtungen verwechseln extrahiert angewendet werden.
Wir entwickelten diese Methode auf die Änderungen in der nuklearen Proteom und Chromatin Maskenbild, die zu Krankheiten beitragen verstehen. 14 jedoch andere Anwendungen umfassen studieren Stimulus-spezifische Änderungen in der Proteom-Zusammensetzung in der normalen Physiologie. Darüber hinaus bietet Subfraktionierung die Möglichkeit für eine neue Stufe der Charakterisierung, wie die Proteine zu betreiben und zu lokalisieren über verschiedene funktionelle Bereiche des Zellkerns.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Vondriska Labor ist durch Zuschüsse aus dem National Heart, Lung and Blood Institute der NIH und der Laubisch Endowment an der UCLA unterstützt. EM ist Empfänger der Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship für Physiologie an der UCLA; HC ist der Empfänger einer American Heart Association Pre-Doc-Stipendium; MP ist der Empfänger einer NIH Ruth Kirschstein Post-Doktoranden-Stipendium und SF ist der Empfänger von ein NIH K99 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 | |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 | |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | ||
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | ||
| Oriole | BioRad | 161-0496 | |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 | |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 | |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 | |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 | |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 | |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 | |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 | |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 | |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
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