Allevamento e iniezione di<em> Manduca sexta</em> Le larve per valutare virulenza batterica
Summary
Il metodo qui descritto utilizza l'iniezione diretta di batteri entomopatogeni nella hemocoel di<em> Manduca sexta</em> Larve di insetti.<em> M. Sexta</em> È un insetto disponibile in commercio e ben studiata. Quindi, questo metodo rappresenta un approccio semplice per analizzare interazioni host-batteriche dalla prospettiva di uno o entrambi i partner.
Abstract
Manduca sexta, comunemente noto come il hornworm tabacco, è considerato un parassita agricolo significativo, nutrendosi di piante solanacee tra cui tabacco e pomodoro. La suscettibilità di M. larve sexta ad una varietà di specie di batteri entomopatogeni 1-5, così come la ricchezza di informazioni disponibili riguardo al sistema immunitario dell'insetto 6-8, e la sequenza del genoma in attesa di 9 ne fanno un organismo buon modello per l'uso in studio delle interazioni ospite-microbo durante la patogenesi. Inoltre, M. larve sexta sono relativamente grandi e facili da manipolare e mantenere nel relativo laboratorio per altre specie sensibili insetti. Loro grandi dimensioni facilita anche efficiente tessuto / emolinfa estrazione per analisi della risposta dell'ospite all'infezione.
Il metodo qui presentato descrive l'iniezione diretta di batteri nella hemocoel (cavità sangue) di M. Sexta larve. Questo approcciopuò essere utilizzato per analizzare e confrontare le caratteristiche di virulenza di varie specie batteriche, ceppi mutanti, o semplicemente controllare il tempo di morte insetto dopo l'iniezione. Questo metodo è stato sviluppato per studiare la patogenicità di Xenorhabdus e specie Photorhabdus che associano di norma con i vettori di nematodi come mezzo per entrare in l'insetto. Nematodi entomopatogeni in genere infettano le larve tramite digestivo naturale o aperture respiratorie, e di rilasciare il loro contenuto simbiotici batteriche nella emolinfa insetto (sangue) poco dopo 10. Il metodo descritto qui di iniezione evita il bisogno di un vettore nematode, quindi sganciare gli effetti dei batteri e nematodi sul insetto. Questo metodo permette di conteggio accurato del materiale infetto (cellule o proteine) entro l'inoculo, che non è possibile utilizzare altri metodi esistenti per analizzare entomopathogenesis, compresi nick 11 e saggi di tossicità orale 12 <em>. Inoltre, test di tossicità orale affrontare la virulenza di tossine secrete introdotte nel sistema digerente delle larve, mentre il metodo di iniezione diretta affronta la virulenza di cellule intere inoculi.
L'utilità del metodo di iniezione diretta, come descritto qui è analizzare patogenesi batterica monitorando mortalità insetto. Tuttavia, questo metodo può essere facilmente espanso per uso a studiare gli effetti di infezione sul M. sexta sistema immunitario. L'insetto risponde alle infezioni tramite sia le risposte umorali e cellulari. La risposta umorale comprende il riconoscimento di batteri associati modelli e conseguente produzione di vari peptidi antimicrobici 7, l'espressione di geni che codificano questi peptidi possono essere monitorati dopo infezione diretta tramite estrazione di RNA e PCR quantitativa 13. La risposta cellulare di infezione coinvolge nodulazione, incapsulamento, e fagocitosi di agenti infettivi attraverso emociti 6 </sup>. Per analizzare queste risposte, insetti iniettato può essere sezionato e visualizzati mediante microscopia 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'iniezione diretta di M. larve sexta con batteri entomopatogeni, come descritto qui, serve come un mezzo semplice ed efficace per analizzare la virulenza batterica. Il metodo è anche forte adattabilità a diversi soggetti sperimentali e / o condizioni. I batteri possono essere preparati in diversi modi prima dell'iniezione. Nel caso di X. nematophila, le cellule coltivate in di tipo selvatico ricco di sostanze nutritive Luria-Bertani (LB) medio a metà-log fase sono in genere i più …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri passati del Goodrich Blair-lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, e Youngjin Parco per il loro contributo allo sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation concessione IOS-0950873 e il National Institutes of Health NRSA comunione FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
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