Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em> Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi> Larva
Summary
Yöntemin hemocoel içine entomopatojenik bakteri doğrudan enjeksiyon kullanır burada açıklanan<em> Manduca Sexta</em> Böcek larvaları.<em> M. Sexta</em> Piyasada bulunan ve iyi çalışılmış böcek türüdür. Bu nedenle, bu yöntem, bir veya her iki ortağın perspektifinden konak-bakteri etkileşimleri analiz için basit bir yaklaşımı temsil etmektedir.
Abstract
Yaygın olarak bilinen bir tütün hornworm Manduca Sexta, domates ve tütün içeren solanaceous bitkilerle beslenen, önemli bir tarımsal zararlıların olarak kabul edilir. M. duyarlılık entomopatojenik bakteri türleri 1-5, hem de böcek bağışıklık sistemi 6-8 ile ilgili olarak mevcut olan bilgi birikimini çeşitli Sexta larva ve beklemede olan genom sekansı 9 bu konak-mikrop etkileşimleri araştırılmasında kullanım için iyi bir model organizma yapmak patogenezi sırasında. Buna ek olarak, M. Sexta larvaları diğer duyarlı böcek türüne laboratuar göreli olarak işlemek ve sürdürmek için nispeten büyük ve kolay. Onların büyük boyutu da enfeksiyona konak yanıtının analizi için etkili doku / hemolimf ekstraksiyon kolaylaştırır.
Burada sunulan yöntem M. hemocoel içine bakterilerin direkt enjeksiyon (kan boşluğu) açıklar Sexta larva. Bu yaklaşımsadece enjeksiyonundan sonra böcek ölüme zaman izleyerek, çeşitli bakteri türleri, suşları, ya da mutantlarının virülans özelliklerini incelemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem genellikle böcek girmesinden kazanmak için bir araç olarak nematod vektörleri ile ilişkilendirmek Xenorhabdus ve Photorhabdus türlerin patojenite incelemek için geliştirilmiştir. Entomopatojen nematodlar genellikle doğal sindirim veya solunum açıklıklar yoluyla larva enfekte ve böcek hemolimf (kan) kısa bir süre sonra 10 içine onların simbiyotik bakteri içeriğini yayınlayacak. Burada açıklanan yöntem ve böylece enjeksiyon böcek üzerinde bakteri ve nematod etkileri ayrılmasının bir nematod vektör için ihtiyaç atlar. Bu yöntem, nickleme 11 ve oral toksisite deneyleri 12 de dahil olmak üzere, entomopathogenesis analiz etmek için var olan diğer yöntemler kullanılarak mümkün değildir inokulum, içinde bulaşıcı malzemenin doğru sayımı (hücre ya da protein) için olanak sağlar <edirekt enjeksiyon yöntemi tam hücreli inokulum virülans adresleri ise m>. Ayrıca, oral toksisite testleri, larvaların sindirim sistemine girmiş salgılanan toksinler virülans ele.
Burada açıklandığı gibi direkt enjeksiyon yöntemi programı Böcek ölümleri takip ederek bakteriyel patogenez analiz etmektir. Bununla birlikte, bu metod M. üzerindeki enfeksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak kullanılmak üzere genişletilebilir Sexta bağışıklık sistemi. Böcek humoral ve hücresel yanıtları hem yoluyla enfeksiyona yanıt verir. Beden irinterine ait tepki ile ilişkili bakteri desen ve tanıma farklı antimikrobiyal peptitler daha sonraki üretim 7 içerir; bu peptitlerin kodlayan genlerin ekspresyonu RNA ekstraksiyonu ve PCR kantitatif 13 aracılığıyla doğrudan enfeksiyonu takiben izlenebilir. Enfeksiyon hücresel yanıt nodülasyon, kapsülleme ve hemocytes 6 Enfeksiyöz ajanlar fagositozu içerir </sup>. Bu tepkileri analiz etmek için, enjekte böcekler disseke ve mikroskopi 13, 14 tarafından görüntülenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
M. direkt enjeksiyon Burada açıklandığı gibi entomopatojen bakterilerle Sexta larva, bakteriyel virulans analiz için basit ve etkili bir araç olarak hizmet vermektedir. Yöntemi farklı deneysel konularda ve / veya koşullara göre aynı zamanda son derece uyarlanabilir. Bakteriler enjeksiyon öncesinde çeşitli şekillerde hazırlanabilir. X'in durumda nematophila, orta-günlük faz besin açısından zengin Luria-Bertani (LB) ortamda yetişen yabani türü hücre enjeksi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Goodrich-Blair laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard ve Youngjin Park bu protokolün gelişmesine katkılarından dolayı. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-0950873 ve Sağlık NRSA dostluk FAI084441Z Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
Riferimenti
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
