Visualisering Bakterier i Nematoder med fluorescensmikroskopi

Summary

För att studera mutualism mellan<em> Xenorhabdus</em> Bakterier och<em> Steinernema</em> Nematoder, metoder har utvecklats för att övervaka bakteriell närvaro och plats inom nematoder. Den experimentella tillvägagångssätt, som kan tillämpas på andra system, medför tekniska bakterier att uttrycka grönfluorescerande protein och visualisera, användning fluorescensmikroskopi bakterier i det transparenta nematoden.

Abstract

Symbioser den bor tillsammans med två eller flera organismer, är utbredd i alla riken i livet. Som två av de mest allmänt förekommande organismerna på jorden, nematoder och bakterier bildar ett brett utbud av symbiotiska associationer som sträcker sig från till nytta för patogena ^1-3. En sådan förening är ömsesidigt givande relation mellan Xenorhabdus bakterier och Steinernema nematoder, som har blivit en modell för system av symbios ^4. Steinernema nematoder är entomopatogena, använder sin bakteriell symbiont att döda insekter ^5. För överföring mellan insektsvärdar, bakterierna koloniserar tarmen av nematoden är infektiösa juvenila stadium ^6-8. Nyligen, har flera andra nematodarter visats utnyttja bakterier för att döda insekter ^9-13, och undersökningar har börjat undersöka interaktionen mellan nematoderna och bakterier i dessa system <sup> 9.

Vi beskriver ett förfarande för visualisering av en bakteriell symbiont inom eller på en nematod värd, dra nytta av den optiska transparens av nematoder när den betraktas av mikroskopi. Bakterierna är utformade för att uttrycka ett fluorescerande protein, tillåter deras visualisering med fluorescensmikroskopi. Många plasmider finns tillgängliga som bär gener som kodar för proteiner som fluorescerar vid olika våglängder (dvs. grönt eller rött), och konjugering av plasmider från en donator Escherichia coli-stam i en mottagande bakteriell symbiont är framgångsrik för ett brett spektrum av bakterier. De beskrivna metoderna har utvecklats för att undersöka sambandet mellan Steinernema carpocapsae och Xenorhabdus nematophila ^14. Liknande metoder har använts för att undersöka andra nematod-bakterien föreningar ^{9, 15-18} och tillvägagångssättet är därför allmänt tillämplig.

The Method tillåter karakterisering av bakteriell närvaro och lokalisering inom nematoder i olika utvecklingsstadier, vilket ger insikter i natur föreningen och processen av kolonisation ^{14, 16, 19.} Mikroskopisk analys avslöjar både kolonisering frekvens inom en population och lokalisering av bakterier som värd vävnader ^{14, 16, 19-21.} Detta är en fördel jämfört med andra metoder för övervakning bakterier inom nematod populationer, till exempel ultraljud ²² eller slipning ^23, som kan ge genomsnittliga nivåer kolonisering, men kan till exempel inte, diskriminera populationer med en hög frekvens av låga symbiont laster från populationer med en låg frekvens av höga symbiont belastningar. Diskriminera frekvens och belastning av koloniserande bakterier kan vara särskilt viktigt när screening eller karakterisera bakteriella mutanter för kolonisering fenotyper ^{21, 24.} I själva verket har fluorescensmikroskopi använts i högkapacitetsscreening av bakteriella mutanter för defekter i kolonisering ^{17, 18,} ​​och är mindre arbetskrävande än andra metoder, inkluderande sonikering ^{22, 25-27} och individuell nematoder dissektion ^{28, 29.}

Protocol

1. Konstruktion av en fluorescerande bakteriestam via Konjugering Odla mottagaren stam (symbiont skall undersökas) och givare stam natten. Givaren stammen, vanligtvis Escherichia coli, bör ha förmåga att donera DNA genom konjugation och bör transformeras med en plasmid (tabell 2) som bär en gen som kodar ett fluorescerande protein. Beroende på plasmiden, kan en konjugering hjälpare stam också krävas. Om så är fallet bör denna stam också odlas över natten. Givaren stamm…

Discussion

Protokollet som beskrivs här tillhandahåller en metod för optisk detektering av bakterier i en nematod värd (figur 1). Denna metod drar fördel av den optiska transparens av nematoder och förmågan att fluorescerande märka bakterier, möjliggör in vivo-analys av bakterier inom nematoden värd (figur 3). Specifikt identifierar detta tillvägagångssätt bakteriell lokalisering i sin värd. Genom att räkna en nematodpopulation och poäng för bakteriell närvaro kan frekv…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM