Zebrafish भ्रूण के चयापचय प्रोफ़ाइल विश्लेषण

Summary

Zebrafish कि चयापचय के अध्ययन के लिए कम उपयोग किया गया है एक शक्तिशाली हड्डीवाला मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं. यहाँ हम एक तेजी से रास्ता नाप का वर्णन<em> Vivo में</em> विकासशील zebrafish कि आनुवंशिक या pharmacologically चालाकी से भ्रूण के बीच अलग mitochondrial समारोह मानकों की तुलना की अनुमति देता है, जिससे इस जीव के लागू करने में वृद्धि की चयापचय प्रोफ़ाइल.

Abstract

चयापचय के क्षेत्र में एक से बढ़ लक्ष्य mitochondrial समारोह के विभिन्न पहलुओं पर आनुवंशिकी के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए है. इन रिश्तों को समझना mitochondrial रोग, मधुमेह और मोटापे के रूप में के साथ जुड़े रोगों की एक श्रृंखला के लिए अंतर्निहित एटियलजि को समझने में मदद मिलेगी. इंस्ट्रूमेंटेशन के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों, सेल लाइनों या ऊतक explants में mitochondrial समारोह के विशिष्ट मानकों की निगरानी के लिए सक्षम है. यहाँ हम vivo में mitochondrial समारोह मानकों के zebrafish भ्रूण के विकास के दौरान तेजी से और संवेदनशील Seahorse bioscience XF 24 कोशिकी प्रवाह विश्लेषक का उपयोग विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल आइलेट कब्जा जहां एक ही भ्रूण प्रत्येक कुएं में रखा गया है microplates, bioenergetics की माप की अनुमति है, जिनमें शामिल हैं: (i) बेसल श्वसन, (ii) बेसल mitochondrial श्वसन (iii) mitochondrial एटीपी कारोबार के लिए कारण श्वसन, mitochondrial (iv) uncoupled श्वसन या जनसंपर्कOton रिसाव और (iv) अधिकतम श्वसन. इस दृष्टिकोण भ्रूण zebrafish श्वसन मापदंडों का उपयोग जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से परिवर्तित (उत्परिवर्ती, जीन से अधिक अभिव्यक्ति या जीन पछाड़ना) भ्रूण या pharmacologically चालाकी से लोगों के बीच तुलना की जा सकती है. यह अनुमान है कि इस प्रोटोकॉल के प्रसार के नए उपकरणों के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए यह प्रासंगिक हड्डीवाला पशु मॉडल में vivo में चयापचय विकारों के आनुवंशिक आधार का विश्लेषण करेगा.

Protocol

भाग 1: zebrafish भ्रूण के रासायनिक उपचार निषेचन के बाद zebrafish भ्रूण ले लीजिए. 28.5 पर सेते ° सी 100 में E3 मध्यम × 15 मिमी पेट्री डिश नोट: स्वस्थानी संकरण या तेल लाल हे धुंधला हो जाना, एक 0.2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में फिनाइल – 2 – thiourea (पी टी यू) से जोड़ा जाता है वर्णक गठन, 1 लेकिन Seahorse विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है रोकना. औषधीय अध्ययनों के लिए लगभग 26 घंटा पोस्ट निषेचन (HPF) zebrafish भ्रूण को विकसित करने के लिए एक उपयुक्त अंतिम एकाग्रता में एक उपयुक्त वाहन केवल नियंत्रण नोट के साथ आवश्यक रासायनिक जोड़ें: प्रकाश के प्रति संवेदनशील औषधीय inhibitors के लिए, भ्रूण में विकसित करने के लिए अनुमति दी जा सकती है अंधेरे विश्लेषण करने से पहले. भाग 2: लाइव मेटाबोलिक Seahorse XF 24 विश्लेषक का प्रोफ़ाइल प्रत्येक रन से पहले, Seahorse XF 24 विश्लेषक कारतूस कि ओ 2 और एच घरों <sऊपर> + fluorophores विश्लेषक द्वारा निष्पादित एक स्वचालित प्रक्रिया के माध्यम से calibrated है. 24 अच्छी तरह XF 24 आइलेट थाली की तैयारी. निम्नलिखित प्रयोगात्मक अनुक्रम कार्यरत है: ऑक्सीजन की खपत के बाद से तापमान के उतार चढ़ाव के प्रति संवेदनशील है, चार कुओं थाली भर संभव तापमान के उतार चढ़ाव के लिए नियंत्रित करने के लिए किया जाता है. इन कुओं भ्रूण नहीं होते हैं, लेकिन E3 माध्यम के 700 μl (2A चित्रा) के साथ भरा. शेष 20 कुओं (2.2 भाग देखें) E3 मध्यम और एक भ्रूण प्रत्येक (चित्रा 2B) के 700 μl के साथ भर रहे हैं. एक प्रयोग के लिए, 10 भ्रूण वाहन (नियंत्रण) और केवल 10 रासायनिक अवरोध करनेवाला (इलाज) के साथ इलाज के साथ व्यवहार कर रहे हैं. नियंत्रण और इलाज भ्रूण alternated (:;: इलाज भ्रूण: अच्छी तरह A4: नियंत्रण भ्रूण, अच्छी तरह से भ्रूण A5 इलाज, आदि अच्छी तरह A3 नियंत्रण भ्रूण A2 उदाहरण के लिए) कर रहे हैं. एक आइलेट कब्जा स्क्रीन के शीर्ष पर जोड़ा जाता हैप्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना परख भर माप चैम्बर (चित्रा 2B) में रहता है नोट: रासायनिक इलाज भ्रूण कोई रासायनिक पहले Seahorse विश्लेषक चलाने धोने की जरूरत के साथ पूरी प्रक्रिया के दौरान उनके मूल रासायनिक घोल के साथ रहते हैं कार्यक्रम. समाप्त होने पर, थाली Seahorse विश्लेषक में भरी हुई है और परख शुरू कर दिया है. नमूनों के विश्लेषण से. दो अलग assays नियमित प्रदर्शन कर रहे हैं. बेसल श्वसन / श्वसन अधिकतम कार्यक्रम (अवधि लगभग 90 मिनट.). बेसल श्वसन में बदलाव चयापचय में शिथिलता पिन, जबकि अधिकतम श्वसन कुल ऊर्जा उत्पादन क्षमता है और इस रोग और शारीरिक दोनों राज्यों के एक नंबर के साथ जुड़े पैरामीटर में परिवर्तन का एक उपाय है. स्पेयर सांस की क्षमता, या आगे एटीपी के उत्पादन में वृद्धि करने के लिए प्रणाली के लिए क्षमता, भी गणना की हैअधिकतम श्वसन से बेसल के घटाव द्वारा इस परीक्षण से. प्रत्येक मिश्रण के तीन दोहराता (2 मिनट) / प्रतीक्षा (1 मिनट) / (2 मिनट) माप चक्र 1 बेसल श्वसन स्थापित करने के लिए किया जाता है. तीसरे चक्र के अंत में, FCCP की 2.5 सुक्ष्ममापी (mitochondrial protonophore / uncoupler) की एक अंतिम एकाग्रता अच्छी तरह से अधिकतम श्वसन की माप की अनुमति प्रत्येक के लिए जोड़ा गया है. माप चक्र तो 5 से 8 बार दोहराया है (3 चित्रा). एटीपी रिसाव / कारोबार प्रोटॉन कार्यक्रम (अवधि लगभग 60 मिनट). एटीपी कारोबार के कारण श्वसन mitochondria की एटीपी के उत्पादन के रूप में मुख्य समारोह का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि प्रोटॉन रिसाव, या uncoupled श्वसन के कारण श्वसन, inextricably बेसल श्वसन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों गठन सहित mitochondrial समारोह के अन्य मानकों के साथ जुड़ा हुआ है. एटीपी कारोबार के कारण श्वसन श्वसन में अंतर से 25 सुक्ष्ममापी oligomycin के अलावा (एक के एक अवरोध के बाद प्रतिनिधित्व किया हैSynthase टी.पी.) बेसल श्वसन की तुलना. Uncoupled श्वसन, या प्रोटॉन रिसाव के कारण श्वसन, 25 सुक्ष्ममापी rotenone (एक जटिल मैं अवरोध करनेवाला) के अलावा के बाद oligomycin मध्यस्थता श्वसन और श्वसन के बीच अंतर की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है. मापन चक्र प्रत्येक mitochondrial अवरोध करनेवाला के अलावा के बाद 8 बार दोहराया जाता है. रनों के अंत मतलब, 10 नियंत्रण और 10 भ्रूण रासायनिक उपचार के मूल्यों की गणना कर रहे हैं. भाग 3: तेल लाल हे धुंधला 50 HPF में भ्रूण ठीक संदंश dechorionated और तय 4% पीएफए ​​में 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात तेल लाल हे धुंधला हो प्रदर्शन किया है, के रूप में पहले 2 वर्णित (4 चित्र देखें).

Representative Results

हम चयापचय, विशेष रूप से श्वसन दर और लिपिड चयापचय पर भूमिका विशिष्ट जीन को समझने में रुचि रखते हैं. इसलिए, हम इन जीनों में से एक द्वारा इनकोडिंग एंजाइम की एक विशिष्ट औषधीय अवरोध करनेवाला के साथ 26 HPF के बाद से जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण का इलाज किया. 50 HPF, वाहन और अवरोध करनेवाला इलाज भ्रूण के आधे mitochondrial समारोह के लिए Seahorse का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है, जबकि शेष आधी 4% में तय किया गया पीएफए ​​4 में रातोंरात डिग्री सेल्सियस और बाद में तेल लाल O साथ लिपिड बयान के लिए दाग. विशेष एंजाइम अवरोध करनेवाला के साथ उपचार एक ~ 2 बेसल श्वसन में गुना वृद्धि (4A चित्रा), जो telencephalon में विशेष रूप से और कान पुटिका (चित्रा 4B, सी) के नीचे लिपिड बयान में वृद्धि के साथ जुड़े थे नेतृत्व किया. / pload/4300/4300fig1highres.jpg "> चित्रा 1. Zebrafish भ्रूण के रासायनिक उपचार के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व wildtype, आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ या pharmacologically इलाज zebrafish भ्रूण पृष्ठभूमि के हैं. चित्रा 2. XF24 आइलेट थाली सेट (ए) चार कुओं तापमान नियंत्रण के रूप में ही भ्रूण मध्यम होते (एक एक्स द्वारा चिह्नित) और दूसरों को एक भ्रूण / अच्छी तरह से होते हैं. (बी) के बंद के एक अच्छी तरह से (C6) एक 50 HPF जंगली प्रकार के वाहन (DMSO) एक आइलेट कब्जा स्क्रीन (arrowhead) द्वारा कवर के साथ इलाज किया भ्रूण दिखा. चित्रा 3. Respiratजंगली प्रकार 50 HPF zebrafish भ्रूण के लिए आयन मानकों. (ए) प्रत्येक माप के लिए, 20 व्यक्ति भ्रूण के मतलब प्रस्तुत किया है. बेसल श्वसन (:;: 75.7, SEM: एसडी 299.7 मीन 16.9), अधिकतमबिटरेट श्वसन (मतलब: 387.4, एसडी: 93.3, SEM: 20.9), स्पेयर सांस की क्षमता (मतलब: 87.7, एसडी: 72.0, SEM: 16.1). (बी) प्रत्येक माप के लिए, 20 व्यक्तिगत परिणाम का मतलब प्रस्तुत किया है. बेसल mitochondrial श्वसन, mitochondrial uncoupled श्वसन और गैर mitochondrial श्वसन, mitochondrial एटीपी कारोबार कारण श्वसन. : माउंट, mitochondrial एसआरसी: स्पेयर सांस की क्षमता, एसडी: मानक विचलन, SEM: मीन की मानक त्रुटि. परिणाम 2 हे की pmol में प्रस्तुत कर रहे हैं भस्म / / मिनट भ्रूण बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . चित्रा 4. प्रतिनिधिबेसल श्वसन और लिपिड बयान पर रासायनिक जोखिम के sentative परिणाम (ए, बी) 50 HPF भ्रूण पार्श्व दृश्य में तेल लाल हे के साथ दाग. चयनात्मक अवरोध करनेवाला (बी) के साथ incubated भ्रूण अधिक तेल लाल हे telencephalon (arrowhead) में और कान पुटिका (तीर) के नीचे एक नियंत्रण वाहन इलाज भ्रूण की तुलना में धुंधला हो जाना दिखाता है. (सी) बेसल श्वसन एक ~ रासायनिक उपचार भ्रूण (n = समूह प्रति 10 भ्रूण) में 2 गुना वृद्धि से पता चलता है. परिणाम 2 हे / / मिनट भ्रूण pmol में प्रस्तुत कर रहे हैं.

Discussion

Zebrafish दोनों (ENU mutagenesis) आगे और रिवर्स (तिलिन्ग, जस्ता उंगली nuclease लक्षित दस्तक बाहर, morpholino पछाड़ना) आनुवंशिक दृष्टिकोण ^{3,4 के} लिए एक अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक मॉडल है, जबकि zebrafish भ्रूण में जीन समारोह भी आसानी से अवरुद्ध किया जा सकता है या सक्रिय चयनात्मक औषधीय इनकोडिंग उत्पादों के लिए विशिष्ट यौगिकों का उपयोग. उनके बाहरी विकास और छोटे आकार के कारण, zebrafish भ्रूण चयापचय विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं. हालांकि, चयापचय प्रोफ़ाइल और zebrafish भ्रूण में vivo में mitochondrial समारोह के मजबूत माप, केवल एक प्रारंभिक विवरण के साथ नहीं हासिल किया गया है ⁵ की सूचना दी. Seahorse विश्लेषण मूल कोशिका आधारित चयापचय के अध्ययन के लिए डिजाइन किया गया है और सही और विश्वसनीय परिणाम ⁶ देने के लिए प्रदर्शन किया गया. इस नई पद्धति के zebrafish भ्रूण के लिए आवेदन महत्वपूर्ण है, और चयापचय अध्ययन के लिए इस मॉडल का व्यापक उपयोग में वृद्धि की संभावना है.

इस अध्ययन में, हम zebrafish Seahorse बेसल श्वसन, अधिक से अधिक श्वसन, स्पेयर सांस की क्षमता, एटीपी कारोबार और प्रोटॉन रिसाव सहित विश्लेषक, का उपयोग भ्रूण में श्वसन मानकों की एक श्रृंखला के माप को प्रदर्शित करता है. हम भी कैसे इस तरह के मापन इस मामले लिपिड संचय में, और इस परख प्रणाली में औषधीय inhibitors का उपयोग अन्य शारीरिक मापदंड, साथ सहसंबद्ध किया जा सकता का एक उदाहरण प्रदान करते हैं. आनुवंशिक रूप से परिवर्तित भ्रूण के उपयोग के साथ संयुक्त, यह चयापचय को प्रभावित करने वाले कारकों को समझने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है.

इस नई पद्धति के लिए आवेदन के साथ एक mitochondrial रोग डायबिटीज मेलिटस ^{7, 8} मोटापा, एकाधिक काठिन्य ^9, पार्किंसंस रोग ^10, अल्जाइमर रोग ¹¹ और ¹² के कैंसर के कुछ प्रकार के रूप में कई मानव रोगों में फंसा है, विभिन्न प्रकार के होते हैं. महत्वपूर्ण बात ओ,साइटोकिन्स, विकास से संबंधित विकास आदि जैसे – उर काम vivo, जहां सभी पर्यावरणीय प्रभावों में किया जाता है सक्रिय हैं, जिससे vivo श्वसन और चयापचय प्रोफ़ाइल में एक physiologically प्रासंगिक दृश्य प्रदान. रासायनिक स्क्रीन के रूप में भी नियमित जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि (1 चित्रा) zebrafish भ्रूण, उपन्यास दवाइयों कि प्रभाव श्वसन mitochondria समारोह या चयापचय आसानी Seahorse विश्लेषक का उपयोग पहचान सकता है में प्रदर्शन कर रहे हैं. Seahorse विश्लेषक का उपयोग उत्पन्न परिणाम अन्य assays के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए. यह तेल लाल धुंधला के रूप में शारीरिक विश्लेषण, या आणविक विश्लेषण, ऐसे cebpα, Pparα के रूप में विशिष्ट adipocyte मार्करों के लिए स्वस्थानी संकरण में के रूप में, Pparγ, आदि FAS शामिल कर सकते हैं

इस पद्धति के लिए कुछ सीमाएं रहते हैं. हालांकि हम दूसरों meas के लिए oligomycin का उपयोग करने में सक्षम थेure एटीपी उत्पादन और युवा ⁵ (चित्र देखें 3) 60 HPF oligomycin उपचार से अधिक पुराने भ्रूण, भ्रूण पर प्रोटॉन रिसाव अक्षम है. हम मानते हैं कि पुराने भ्रूण में oligomycin के रूप में आसानी से नहीं की तुलना में युवा परिणाम व्याख्या करने के लिए असंभव बना भ्रूण में विसरित कर सकते हैं. चूंकि oligomycin परिणाम एटीपी कारोबार और uncoupled श्वसन के कारण श्वसन के निर्धारण के लिए अनिवार्य कर रहे हैं, हम वर्तमान में उम्र भ्रूण के लिए उच्च oligomycin की सांद्रता की जांच कर रहे हैं. हालांकि, antimycin उपचार प्रभावी बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन और स्पेयर सांस की क्षमता, पुराने zebrafish भ्रूण में किया जा सकता है, 68 HPF (नहीं दिखाया गया है) के रूप में अन्य माप, के साथ लंबे समय तक रहते हैं.

वर्तमान Seahorse विश्लेषक सेटअप का उपयोग करने में एक और सीमा प्रत्येक आइलेट पर कब्जा प्लेट के भीतर अच्छी तरह से शारीरिक अंतरिक्ष, ऐसी है कि वे केवल zebrafish भ्रूण और युवा लार्वा के लिए उपयुक्त हैं. इसलिए, metabol प्रदर्शनवयस्क मछली आहार प्रेरित मोटापे आईसी अध्ययन, उदाहरण के लिए, अभी तक तकनीकी रूप से संभव नहीं है. हालांकि, इस अध्ययन में विशेष रूप से किशोर या वयस्क मछली के लिए तैयार प्लेटों के विकास का संकेत है, जिससे संभावित विश्लेषण के दायरे का विस्तार हो सकता है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
XF 24 extracellular flux analyser	Seahorse Bioscience	100737-101	24 well format
Islet Capture microplate	Seahorse Bioscience	101122-100	24 well format
XF Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000
XF Assay Medium	Seahorse Bioscience	101022-100
Oil-Red-O	Sigma-Aldrich	O0625
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml51
E3 (embryonic medium)	Self made	–	http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16
100X15 mm Petri dishes	Falcon	35-1029
FCCP	Sigma	C2920
Oligomycin	Sigma	75351
Antimycin A	Sigma	A8674