Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes
Summary
Les effets de l'activation de la protéine kinase C (PKC) isozymes de la fonction mitochondriale associés à la respiration et la phosphorylation oxydative et sur la viabilité cellulaire sont décrites. L'approche technique s'adapte adénoviral de façon sélective surexprimer isoenzymes de PKC dans une culture cellulaire primaire et une variété de tests pour déterminer les fonctions mitochondriales et l'état énergétique de la cellule.
Abstract
La protéine kinase C (PKC) de la famille des isoenzymes est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Nos données récentes démontrent que la PKC régule la fonction mitochondriale et l'état énergétique cellulaire. De nombreux rapports ont démontré que l'activation de la PKC-a et de la PKC-ε améliore la fonction mitochondriale dans la cardiopathie ischémique et cardioprotection médiateur. En revanche, nous avons montré que la PKC-α et PKC-ε sont impliqués dans nephrotoxicant induite par la dysfonction mitochondriale et la mort cellulaire dans les cellules rénales. Par conséquent, l'objectif de cette étude était de développer un modèle in vitro de cellules rénales maintenir actives les fonctions mitochondriales dans lequel isoenzymes de PKC pourrait être sélectivement activés ou inhibés afin de déterminer leur rôle dans la régulation de la phosphorylation oxydative et la survie cellulaire. Les cultures primaires de cellules tubulaires proximales rénales (RPTC) ont été cultivées dans de meilleures conditions résultant de la respiration mitochondriale et l'activité des mitochondrial enzymes analogues à celles RPTC in vivo. Parce que les techniques de transfection traditionnels (Lipofectamine, l'électroporation) sont inefficaces dans des cultures primaires et avoir des effets néfastes sur la fonction mitochondriale, PKC-ε ADNc mutants ont été livrés à travers RPTC vecteurs adénoviraux. Cette approche se traduit par la transfection de plus de 90% RPTC culture.
Ici, nous présentons les méthodes pour évaluer le rôle de la PKC-ε dans: 1. la régulation de la morphologie des mitochondries et des fonctions associées à la synthèse d'ATP, et 2. survie des RPTC en culture primaire. PKC-ε est activé par surexprimant constitutivement active de la PKC ε-mutant. PKC-ε est inhibée par la surexpression de la mutant inactif de la PKC-ε. La fonction mitochondriale est évaluée en examinant la respiration, de l'intégrité de la chaîne respiratoire, les activités des complexes respiratoires et F 0 F 1-ATPase, le taux de production d'ATP, et la teneur en ATP. La respiration est unssessed dans digitonine-perméabilisées RPTC que l'état 3 (respiration maximale en présence de substrats en excès et ADP) et les respirations découplés. L'intégrité de la chaîne respiratoire est évaluée par la mesure des activités des quatre complexes de la chaîne respiratoire dans les mitochondries isolées. Capacité de phosphorylation oxydative est évaluée par mesure du potentiel de membrane mitochondriale, le taux de production d'ATP, et une activité de F 0 F 1-ATPase. Statut énergétique de RPTC est évaluée par la détermination de la teneur en ATP intracellulaire. Morphologie mitochondriale dans les cellules vivantes est visualisée à l'aide Mitotracker Red 580, un colorant fluorescent qui s'accumule spécifiquement dans les mitochondries, et des monocouches vivants sont examinés sous un microscope à fluorescence. RPTC viabilité est évaluée à l'aide annexine V / iodure de propidium suivie coloration par cytométrie en flux afin de déterminer l'apoptose et oncose.
Ces méthodes permettent une activation sélective / inhibition de la PKC individuelle isozymesafin d'évaluer leur rôle dans les fonctions cellulaires dans une variété de conditions physiologiques et pathologiques qui peuvent être reproduits in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'approche présentée ici permet la surexpression des isozymes de la PKC individuelles dans la culture primaire de cellules tubulaires proximales rénales. Il ya plusieurs points forts de cette approche: 1. Il permet d'enquêter sur les mécanismes de régulation dans une population homogène de cellules (cellules tubulaires proximales rénales) qui sont la principale cible des insultes diverses (ischémie, l'hypoxie, stress oxydatif), les médicaments et nephrotoxicants dans le rein. 2. Fonctions mitochond…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health, l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales, 2R01DK59558 (à GN). UAMS Translational Research Institute soutenu par le National Institutes of Health Centre national de recherche sur les ressources de subvention UL1 RR029884 fourni un financement partiel pour le Core cytométrie en flux à UAMS. Nous remercions le Dr Peipei Ping (Université de Californie à Los Angeles, Los Angeles, CA) pour fournir une aliquote de l'adénovirus portant l'ADNc codant dominant négatif (inactif) mutant de la PKC-ε et le Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) pour fournir un aliquot de vecteur adénoviral codant le mutant constitutivement active de la PKC-ε. Nous remercions également MM. Peter Parker et Peter Sugden (Imperial College London, Londres, Royaume-Uni) pour fournir des ADNc codant constitutivement actives PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
Riferimenti
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