Bedömning av Mitokondriella funktioner och cellviabilitet i Renal celler som överuttrycker proteinkinas C-isozymer
Summary
Effekterna av aktivering av proteinkinas C (PKC) isozymer på mitokondriella funktioner förknippade med andning och oxidativ fosforylering och på cellviabilitet beskrivs. Den strategi anpassar adenoviral teknik för att selektivt överuttrycka PKC isozymer i primär cellkultur och en mängd olika analyser för att fastställa mitokondriella funktioner och energistatus i cellen.
Abstract
Proteinkinas C (PKC) familjen av isozymer är involverad i många fysiologiska och patologiska processer. Våra senaste uppgifter visar att PKC reglerar mitokondriell funktion och cellernas energi status. Talrika rapporter visade att aktiveringen av PKC-a och PKC-ε förbättrar mitokondriell funktion i den ischemiska hjärtat och förmedlar kardioprotektion. I motsats, har vi visat att PKC-α och PKC-ε är involverade i nephrotoxicant-inducerad mitokondriell dysfunktion och celldöd i njurceller. Därför var målet med denna studie att utveckla en in vitro-modell av renala celler upprätthåller aktiva mitokondriella funktioner som PKC-isozymer kan selektivt aktiveras eller hämmas för att fastställa deras roll i regleringen av oxidativ fosforylering och cellöverlevnad. Primära kulturer av renala proximala tubulära celler (RPTC) odlades i förbättrade villkor resulterar i mitokondriell respiration och aktivitet av Mitochondrial enzymer liknande dem i RPTC in vivo. Eftersom traditionella transfektionstekniker (Lipofectamine, elektroporation) är ineffektiva i primära kulturer och har negativa effekter på mitokondriell funktion, var PKC-ε muterade cDNA levereras till RPTC genom adenovirusvektorer. Denna strategi resulterar i transfektion av över 90% odlade RPTC.
Här presenterar vi metoder för att bedöma vilken roll PKC-ε i: 1. reglering av mitokondriell morfologi och funktioner i samband med ATP-syntes och 2. överlevnad RPTC i primär kultur. PKC-ε aktiveras av överuttrycker konstitutivt aktiva PKC-ε mutanten. PKC-ε hämmas av överuttryck den inaktiva mutanten av PKC-ε. Mitokondriefunktion bedöms genom att undersöka andning, integritet andningskedjan, aktiviteter respiratoriska komplex och F 0 F 1-ATPas, ATP-produktion hastighet och ATP innehåll. Respiration är enssessed i digitonin-permeabiliserades RPTC som statligt 3 (maximal andning i närvaro av överskott substrat och ADP) och okopplade respirations. Integritet andningskedjan bedöms genom att mäta verksamheten hos alla fyra komplex av andningskedjan i isolerade mitokondrier. Kapacitet av oxidativ fosforylering utvärderas genom mätning av mitokondriell membranpotential, ATP-produktionshastighet, och aktiviteten hos F 0 F 1-ATPas. Energistatus RPTC bedöms genom bestämning av intracellulära ATP-halten. Mitokondriell morfologi i levande celler visualiseras med hjälp MitoTracker Röd 580, en fluorescerande färg som specifikt ackumuleras i mitokondrierna, och levande monolager undersöks under ett fluorescerande mikroskop. RPTC livskraft bedöms med annexin V / propidiumjodidfärgning följt av flödescytometri för att avgöra apoptos och oncosis.
Dessa metoder medger en selektiv aktivering / inhibering av individuella PKC isozymeratt bedöma deras roll i cellulära funktioner i olika fysiologiska och patologiska tillstånd som kan reproduceras i in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som presenteras här möjliggör överuttryck av individuella isozymer av PKC i den primära kulturen av renala proximala tubulära celler. Det finns flera styrkor av detta tillvägagångssätt: 1. Det möjliggör att undersöka regleringsmekanismer i en homogen population av celler (renala proximala tubulära celler) som är det primära målet för olika förolämpningar (ischemi, hypoxi, oxidativ stress), läkemedel och nephrotoxicants inom njuren. 2. Mitokondriella funktioner i detta in vitro mode…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar, 2R01DK59558 (till GN). UAMS Translationell Research Institute stöds av National Institutes of Health National Center for Research Resources bidrag UL1 RR029884 som delfinansiering för flödescytometri Core vid UAMS. Vi tackar Dr Peipei Ping (University of California i Los Angeles, Los Angeles, Kalifornien) för att ge en alikvot av adenovirus bär cDNA kodning av dominerande negativa (inaktiv) mutant av PKC-ε och Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) för att åstadkomma en alikvot av adenoviral vektor som kodar den konstitutivt aktiva mutanten av PKC-ε. Vi tackar också Dr. Peter Parker och Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) för att ge cDNA kodande konstitutivt aktiva PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
Riferimenti
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
