يوصف أسلوب للمراقبة الفردية جزيئات الحمض النووي في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع أمريكا اللاتينية والكاريبي لتصميم مواقع الربط DNA في المصالح. ويمكن تكييف هذه الطريقة لمتابعة السلطات الوطنية المعينة المؤتلف كثيرة في الخلايا الحية على مر الزمن.
يتم الاحتفاظ بعض البلازميدات طبيعيا في خلايا الثدييات. ومن بين هذه العوامل الوراثية من الهربس غاما، بما في ذلك فيروس ابشتاين بار (EBV) وكابوزي الورم اللحمي المرتبطة هربس (KSHV)، والتي تتسبب الأورام الخبيثة الإنسان متعددة 1-3. يتم نسخ هذه الجينوم الاثنين بطريقة المرخصة، كل باستخدام بروتين واحد الفيروسية والخلوية آلات النسخ المتماثل، وتم تمريرها إلى الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية على الرغم من القسيم التقليدية التي تفتقر إلى 4-8.
وقد تم ذلك الكثير من العمل لتوصيف مكررات هذه الجينوم البلازميد باستخدام أساليب مثل النشاف الجنوبية ومضان التهجين في الموقع (FISH). وتقتصر هذه الأساليب، وإن كان. PCR الكمي والبقع جنوب تقديم معلومات عن متوسط عدد البلازميدات في الخلية في عدد السكان من الخلايا. FISH هو فحص وحيدة الخلية التي تكشف كل من متوسط عدد وتوزيع بلازميد ق في خلية في عدد السكان من الخلايا ولكنها ثابتة، مما يتيح أي معلومات عن الوالد أو سلالة الخلية فحصها.
هنا، نحن تصف طريقة لتصور البلازميدات في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع اللاكتوز إلى مواقع متعددة في البلازميد من الفائدة 9. تم تصميم الحمض النووي التي تهم تشمل يكرر جنبا إلى جنب نحو 250 من المشغل اللاكتوز (LACO) التسلسل. لا بد من البروتين على وجه التحديد LACO وقامع اللاكتوز (اسي)، والتي يمكن أن تنصهر فيها بروتين فلوري. يمكن إما الانصهار البروتين يمكن التعبير عنها من البلازميد هندسيا أو عرضه ناقل فيروسات. وبهذه الطريقة، يتم تمييزها جزيئات DNA fluorescently وبالتالي تصبح مرئية عبر المجهر مضان. يتم حظر البروتين الانصهار من ربط DNA البلازميد من قبل خلايا زراعة في وجود البلازميدات IPTG حتى على استعداد ليتم عرضه.
ontent "> ويتيح هذا النظام ليتم رصدها على البلازميدات في الخلايا الحية من خلال عدة أجيال، وكشف عن خصائص التركيب والتقسيم إلى الخلايا الوليدة. خلايا مثالية هي ملتصقة، تقاس بسهولة، ولها نواة كبيرة. وقد استخدم هذه التقنية لتحديد ما وقد تم تجميع 84٪ من EBV المستمدة من البلازميدات كل جيل و 88٪ من قسم البلازميدات تصنيعه حديثا بإخلاص إلى الخلايا الوليدة في خلايا هيلا. شوهدت أزواج من هذه البلازميدات EBV أن المربوطة أو المرتبطة الكروماتيدات الشقيقة بعد التوليف في S- المرحلة كان ينظر إليها حتى لفصل الكروماتيدات الشقيقة كما فصل في طور الصعود (10) وحاليا تستخدم هذه الطريقة لدراسة الجينوم تكرار KSHV في خلايا هيلا وخلايا SLK. خلايا هيلا وخلد الخلايا الظهارية البشرية، وخلد الخلايا البطانية SLK الإنسان الخلايا. لو كانت مستمدة في الأصل من الخلايا SLK آفة KSHV، لا هيلا ولا SLK خط خلية حرب بشكل طبيعيORS الجينوم KSHV 11. بالإضافة إلى دراسة تكاثر الفيروس، ويمكن استخدام هذه التقنية التصور للتحقيق في الآثار المترتبة على إضافة وإزالة، أو تحور مختلف عناصر تسلسل الحمض النووي على التوليف، التعريب، وتقسيم للسلطات الوطنية المعينة الأخرى البلازميد المؤتلف.ويمكن استخدام الطريقة الموضحة هنا لمتابعة البلازميدات في خلايا الثدييات الحية على مر الزمن والتي تمتد أجيال متعددة. عن طريق الحد من التعرض للضوء الإثارة، وقد استخدمنا هذه التقنيات لمتابعة الخلايا من أزواج حديثا من خلال تقسيم المستعمرات من 16-32 الخلايا، التي تمثل ما ?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وACS، بما في ذلك T32CA009135، CA133027، CA070723، وCA022443. مشروع قانون سودن هو جمعية السرطان الأمريكية أستاذ باحث.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | GIBCO | 11965 | |
OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Penicillin | Sigma | P3032 | |
Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
HEPES | GIBCO | 15630 | |
Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
Axiovert 200M | Zeiss | ||
Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |