ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Summary
שיטה של מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.
Abstract
פלסמידים כמה טבעי, נשמרים בתאי יונקים. בין אלה הגנומים של גאמה, herpesviruses, כולל Epstein-Barr וירוס (EBV) וסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של קפוסי (KSHV), הגורם לממאירויות אדם מרובה 1-3. 2 גנומים אלו משוכפלים באופן מורשה, כל שימוש בחלבון נגיפי אחת ומכונות שכפול תאים, ומועברים לתאי בת בעת חלוקת תא למרות centromeres המסורתי החסר 4-8.
עבודה רבה נעשתה כדי לאפיין את החזרות של הגנום פלסמיד אלה באמצעות שיטות כגון סופג דרום ופלואורסצנטי כלאה באתר (FISH). למרות ששיטות אלו מוגבלות,. כתמי דרום כמותית PCR ולספק מידע על המספר הממוצע של פלסמידים לתא באוכלוסייה של תאים. דגים הם assay תא בודד שמגלה גם את המספר הממוצע וההפצה של פלסמיד תא לים באוכלוסייה של תאים, אבל הוא סטטי, ומאפשר אין מידע על ההורה או צאצאים של התא הנבדק.
כאן, אנו מתארים שיטה להמחשת פלסמידים בתאים חיים. שיטה זו מבוססת על הכריכה של חלבון מדכא קטוז מתויג fluorescently לאתרים מרובים בפלסמיד עניין 9. ה-DNA של עניין מתוכננת לכלול כ 250 חזרות טנדם של מפעיל קטוז (אץ) הרצף. אצו קשור באופן ספציפי על ידי החלבון המדכא קטוז (לאצים), אשר ניתן התמזג לחלבון פלואורסצנטי. חלבון היתוך אחד יכול לבוא לידי ביטוי מפלסמיד המהונדס או הוצג על ידי וקטור retroviral. בדרך זו, מולקולות DNA מתויגות fluorescently ולכן הפכו לגלוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבון ההיתוך חסום מקשירת DNA פלסמיד ידי תאי culturing בנוכחות IPTG עד פלסמידים מוכנים להצגה.
ontent "> מערכת זו מאפשרת את פלסמידים כדי להיות במעקב בתאים חיים דרך כמה דורות, מגלים מאפיינים של הסינתזה שלהם וחלוקה לתאי בת. תאים אידיאליים הם חסיד, transfected בקלות, ויש גרעינים גדולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לקבוע כי 84% מפלסמידים EBV-derived מסונתזים כל דור ו88% ממחיצת פלסמידים המסונתזים חדש בנאמנות לתאי בת בתאי הלה. זוגות של פלסמידים EBV האלה נצפו יהיו כבולים לאו קשור chromatids אחות לאחר הסינתזה שלהם בS- שלב, עד שהם ראו להפריד כchromatids האחות מופרדת בAnaphase 10. השיטה נמצא בשימוש ללמוד שכפול של הגנום בתאי הלה KSHV ותאי SLK. תאי הלה הונצחו תאי האפיתל אדם, ותאי SLK הונצחו אנושי אנדותל תאים. למרות שתאי SLK הופקו במקור מנגע KSHV, לא הלה ולא שורת תאי SLK אופן טבעי חרבהגנום ORS KSHV 11. בנוסף לומד שכפול נגיפי, טכניקת הדמיה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעות של בנוסף, הסרה, או המוטציה של אלמנטי רצף הדנ"א שונים על סינתזה, לוקליזציה, ומחיצות של DNAs פלסמיד רקומביננטי האחר.Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש כדי לעקוב פלסמידים בתאי יונקים חיים לאורך הזמן הפורש מספר דורות. על ידי הגבלת חשיפה לאור עירור, יש לנו להשתמש בטכניקות אלה כדי לעקוב אחר תאים מזוגות שזה עתה מחולק באמצעות מושבות של 16-32 תאים, ובה לפחות 72 שעות ו3 חטיבות סלולריות. ניסויים אלו …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות וACS, כולל T32CA009135, CA133027, CA070723, וCA022443. ביל סאגד הוא פרופסור מחקר אגודה אמריקאי לסרטן.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
Riferimenti
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. . Fields Virology 2 volume set. , (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi’s sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).
