Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência
Summary
Um método de se observar as moléculas individuais de DNA em células vivas é descrito. A técnica baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado repressor lac para os locais de ligação para a engenharia de ADN de interesse. Este método pode ser adaptado para seguir muitas DNAs recombinantes em células vivas ao longo do tempo.
Abstract
Alguns plasmídeos de ocorrência natural são mantidas em células de mamíferos. Entre estes estão os genomas de gama-herpesvírus, incluindo o vírus Epstein-Barr (EBV) e Sarcoma de Kaposi associado herpesvírus (KSHV), que causam várias doenças malignas humanas 1-3. Estes dois genomas são replicadas de forma licenciada, cada um utilizando uma única proteína virai e maquinaria de replicação celular, e são passados para as células filhas durante a divisão celular, apesar de suas faltam centrómeros tradicionais 4-8.
Muito trabalho tem sido feito para caracterizar as repetições destes genomas de plasmídeos usando métodos tais como Southern blotting e hibridação in situ fluorescente (FISH). Estes métodos são limitados, no entanto. Quantitative PCR e Southern blots fornecer informações sobre o número médio de plasmídeos por célula, numa população de células. FISH é um ensaio de célula única que revela tanto o número médio e a distribuição do plasmídeo s por célula na população de células, mas é estático, não permitindo que a informação sobre os pais ou descendência da célula examinadas.
Aqui, nós descrevemos um método para a visualização de plasmídeos em células vivas. Este método baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado lactose repressor para múltiplos locais no plasmídeo de interesse 9. O DNA de interesse foi concebido de modo a incluir de cerca de 250 repetições em tandem do operador lactose (laço) sequência. LACO está especificamente ligada pela proteína do repressor de lactose (LacI), que pode ser fundido a uma proteína fluorescente. A proteína de fusão pode ser expressa a partir do plasmídeo de engenharia ou introduzido por um vector retroviral. Deste modo, as moléculas de ADN são marcados por fluorescência e, portanto, tornam-se visíveis por meio de microscopia de fluorescência. A proteína de fusão é impedido de se ligar ao DNA de plasmídeo por cultura de células na presença de IPTG até os plasmídeos estão prontos para ser visualizado.
ONTEÚDO "> Este sistema permite que os plasmídeos de ser controlados em células vivas através de várias gerações, revelando as propriedades da sua síntese e separação de células filhas. ideais são células aderentes, facilmente transfectada e têm núcleos grandes. Esta técnica tem sido utilizada para determinar que 84% dos doentes com EBV-derivados plasmídeos são sintetizados cada geração e 88% da partição plasmídeos recém-sintetizado fielmente às células em células HeLa. Pairs destes plasmídeos EBV foram vistos a ser ligado a ou associado com cromatídeos irmãos após a sua síntese em S- fase até que se viu a separar como os cromatídeos irmãos separados em Anáfase 10. O método está a ser utilizado para estudar a replicação do genoma KSHV em células HeLa e células SLK. células HeLa são imortalizadas células epiteliais humanas, e as células são imortalizadas SLK endoteliais humanas células. Embora as células SLK foram originalmente derivadas de uma lesão KSHV, nem a células HeLa, nem SLK linha celular naturalmente harbgenomas ors KSHV 11. Além de estudar a replicação viral, esta técnica de visualização pode ser utilizado para investigar os efeitos da adição, remoção, ou mutação de vários elementos de ADN de sequências de síntese, localização e separação de outros DNAs de plasmídeo recombinante.Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui descrito pode ser usado para seguir os plasmídeos em células vivas de mamíferos ao longo do tempo que mede múltiplas gerações. Ao limitar a exposição à luz de excitação, temos usado estas técnicas a seguir a partir de pares de células recém-divididas através de colónias de células 16-32, o que representa, pelo menos, 72 horas e 3 divisões celulares. Estas experiências fornecem informação que não pode ser obtida a partir de ensaios estáticos, tais como PCR quantitativo, Southern blot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da ACS, incluindo T32CA009135, CA133027, CA070723, e CA022443. Bill Sugden é um American Cancer Research Professor Sociedade.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
Riferimenti
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