Övervakning plasmidreplikation i Live däggdjursceller över flera generationer genom fluorescensmikroskopi
Summary
En metod att observera individuella DNA-molekyler i levande celler beskrivs. Tekniken är baserad på bindningen av en fluorescent märkt lac-repressor-protein till bindningsställen manipulerade i DNA av intresse. Denna metod kan anpassas att följa många rekombinanta DNA i levande celler över tiden.
Abstract
Några naturligt förekommande plasmider upprätthålls i däggdjursceller. Bland dessa är genomen hos gamma-herpesvirus, inklusive Epstein-Barr-virus (EBV) och Kaposis sarkom-associerat herpesvirus (KSHV), som orsakar multipla humana maligniteter 1-3. Dessa två genomen replikeras på en licensierad sätt, var och en med en enda viralt protein och cellulär replikering maskiner och skickas till dotterceller under celldelning trots deras saknar traditionella centromerer 4-8.
Mycket arbete har gjorts för att karakterisera replikationer av dessa plasmid genomen med metoder som Southern blotting och fluorescens in situ hybridisering (FISH). Dessa metoder är begränsade, dock. Kvantitativ PCR och Southern blöts ger information om det genomsnittliga antalet plasmider per cell i en population av celler. FISH är en enkel-cellanalys som avslöjar både det genomsnittliga antalet och fördelningen av plasmiden s per cell i populationen av celler men är statisk, så ingen information om förälder eller avkomma av den undersökta cellen.
Här beskriver vi en metod för att visualisera plasmider i levande celler. Denna metod är baserad på bindningen av en fluorescent märkt laktosrepressorproteinet till flera ställen i plasmiden av intresse 9. DNA: t av intresse är konstruerad för att omfatta cirka 250 tandemupprepningar av laktos operatören (LACO) sekvens. LACO specifikt bunden av laktosrepressorproteinet (LACI), som kan smältas till ett fluorescerande protein. Fusionsproteinet kan antingen uttryckas från den manipulerade plasmiden eller introduceras genom en retroviral vektor. På detta sätt, är DNA-molekyler taggade fluorescent och därmed bli synlig via fluorescensmikroskopi. Fusionsproteinet är blockerad från att binda plasmid-DNA genom odling av celler i närvaro av IPTG tills plasmiderna är redo att ses.
ontent "> Detta system tillåter plasmiderna som skall övervakas i levande celler genom flera generationer, avslöjar egenskaper hos deras syntes och uppdelning till dottercellerna. Ideala celler är vidhäftande, lätt transfekterade, och har stora kärnor. Denna teknik har använts för att fastställa att 84% av EBV-härledda plasmider syntetiseras varje generation och 88% av den nysyntetiserade plasmiderna partitionen troget till dotterceller i HeLa-celler. Par av dessa EBV plasmider sågs vara bundna till eller associeras med systerkromatider efter deras syntes i S- fas tills de ansågs att separera som systerkromatider separerade i Anafasa 10. Metoden används för närvarande för att studera replikering av KSHV genomet i HeLa-celler och celler SLK. immortaliseras humana epitelceller, och SLK celler immortaliserade HeLa-celler human endotel celler. Även SLK celler ursprungligen härstammar från en KSHV lesion, varken HeLa eller SLK cellinje Harb naturligtOrs KSHV genomen 11. Förutom att studera virusreplikation, kan denna visualisering teknik användas för att undersöka effekterna av tillägg, borttagning eller mutation av olika element DNA sekvens på syntes, lokalisering och fördelning av andra rekombinanta plasmid-DNA.Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs här kan användas för att följa plasmider i levande däggdjursceller över tiden över flera generationer. Genom att begränsa exponeringen för excitationsljus, har vi använt dessa tekniker för att följa celler från nyligen delade par genom kolonier av 16-32 celler, som representerar minst 72 timmar och 3 divisioner cell. Dessa experiment ger information som inte kan erhållas från statiska analyser såsom kvantitativ PCR, Southern blotting och fisk.
Det är vik…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av bidrag från NIH och ACS, däribland T32CA009135, CA133027, CA070723 och CA022443. Bill Sugden är en American Cancer Society Research Professor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
Riferimenti
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. . Fields Virology 2 volume set. , (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi’s sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).
