El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em> C. elegans</em> Los embriones
Summary
Descrito aquí es un<em> In vivo</em> Técnica de imagen sub-estructuras celulares en animales expuestos a la anoxia usando un flujo de gas a través de la cámara de microincubation en conjunción con un microscopio confocal de disco giratorio. Este método es sencillo y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una variedad de parámetros experimentales y los sistemas del modelo.
Abstract
Caenorhabdits elegans se ha usado extensivamente en el estudio de la resistencia a la tensión, que se ve facilitado por la transparencia de las fases adultas y el embrión así como por la disponibilidad de mutantes genéticos y cepas transgénicas que expresan una miríada de 1-4 proteínas de fusión. Además, los procesos dinámicos tales como la división celular se puede ver con la etiqueta fluorescente proteínas indicadoras. El estudio de la mitosis se puede facilitar mediante el uso de experimentos con lapso de tiempo en los diferentes sistemas, incluyendo organismos intactos, por lo que la temprana C. embrión elegans es muy adecuado para este estudio. Aquí se presenta una técnica mediante la cual la formación de imágenes in vivo de estructuras subcelulares en respuesta a anóxica (99,999% N 2; <2 ppm O 2) el estrés es posible con un flujo de gas a través de la configuración sencilla en un microscopio de alta potencia. Una cámara de microincubation se utiliza en conjunción con el flujo de gas de nitrógeno a través de un microscopio y disco giratorio confocalpara crear un ambiente controlado en el que los animales pueden obtener imágenes in vivo. Uso de GFP-etiquetados tubulina gamma y la histona, la dinámica y la detención de la división celular puede ser controlada antes, durante y después de la exposición a un ambiente privado de oxígeno. Los resultados de esta técnica son de alta resolución, videos detalladas y las imágenes de las estructuras celulares dentro de blastómeros de embriones expuestos a privación de oxígeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
La privación de oxígeno y la animación suspendida
Aunque la exposición a la privación de oxígeno severa puede ser fatal para algunos organismos, algunos organismos son capaces de sobrevivir a la exposición a la anoxia. En el caso de C. elegans, la supervivencia de la exposición anoxia depende de la etapa de desarrollo y respuesta a la anoxia es la entrada en un estado de animación suspendida reversible en el que se detuvo a varios procesos biológicos observables. Los procesos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento por los aportes y comentarios de los miembros del Laboratorio de Padilla. Cepas de nematodos en este trabajo fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis, que es financiado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). Reconocemos y agradecemos el Dr. Lon Turnbull de asistencia técnica con microscopía confocal. Este trabajo ha sido financiado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia (NSF-IOS, CARRERA) para PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
Riferimenti
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