כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.
דרך ביטוי אקטופי של ארבעה גורמי שעתוק, Oct4, Klf4, Sox2 וcMyc, תאים אנושיים סומטיים ניתן להמיר למדינת pluripotent, יצירת תאים שנקראים מושרים pluripotent גזע (iPSCs) 1-4. iPSCs מטופל ספציפי חסר הדאגות המוסריות האופפות תאי גזע עובריים (ESCs) ויעקפו דחייה חיסונית אפשרית. לפיכך, iPSCs שמשך תשומת לב רבה ללימודי מחל דוגמנות, ההקרנה של תרכובות תרופתיות, טיפולי משובים 5.
הראנו הדור של iPSCs האדם transgene חינם מחולים עם מחלות ריאה שונות באמצעות קלטת אחת excisable polycistronic lentiviral תאי גזע (STEMCCA) קידוד יאמאנאקה גורמי 6. קווי iPSC אלה נוצרו מfibroblasts עור, סוג התא הנפוץ ביותר המשמש לתכנות מחדש. בדרך כלל, קבלת fibroblasts דורשת עור ביופסיה ואחרי ההתרחבות של התאזה בתרבות לכמה קטעים. חשוב מכך, מספר הקבוצות דיווח תכנות מחדש של תאי דם היקפי אדם לiPSCs 7-9. במחקר אחד, גרסה מושרה ט של וקטור STEMCCA הועסקה 9, שנדרשת תאי הדם להידבק בו זמנית עם lentivirus constitutively פעיל קידוד טטרציקלין transactivator ההפוך. בניגוד לפיברובלסטים, תאי דם היקפיים ניתן לאסוף באמצעות נהלים פולשנית, צמצום אי הנוחות ומצוקתו של החולה באופן משמעותי. פרוטוקול פשוט ויעיל לתכנות מחדש של תאי דם באמצעות וקטור excisable אחת מכונן עשוי להאיץ את היישום של טכנולוגית iPSC על ידי שהופך אותו נגיש לקהילת מחקר רחבה יותר. יתר על כן, תכנות מחדש של תאי דם היקפיים מאפשר לדור של iPSCs מאנשים שביש להימנע מהם ביופסיות עור (כלומר. חריג הצטלקות) או עקב תנאי מחלה קיים preventiגישת ננוגרם לביופסיות אגרוף.
כאן אנו מדגימים פרוטוקול עבור הדור של iPSCs אדם מתאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) באמצעות וקטור lentiviral floxed-excisable אחת constitutively להביע 4 הגורמים. PBMCs נאסף טרי או מופשר הם התרחבו במשך 9 ימים כפי שתוארו 10,11 בחומצה אסקורבית המכילה בינונית, SCF, IGF-1, IL-3 ו-EPO לפני שtransduced עם lentivirus STEMCCA. תאים אז מצופים על MEFs ומושבות ESC דמויים יכולות להיות דמיינו שבועות לאחר הדבקה. לבסוף, שיבוטים נבחרו הורחבו ונבדקו לביטוי של סמני pluripotency SSEA-4, טרה-1-60 וטרה-1-81. פרוטוקול זה הוא פשוט, הגיוני ועקבי ביותר, ומספק מתודולוגיה אמינה לדור של iPSCs אדם מ4 מ"ל נגיש של דם.
אנחנו להלן מתארים את השימוש של וקטור lentiviral STEMCCA לייצר iPSCs אדם מתאי mononuclear בודד מכמה מיליליטרים של דם היקפי נאסף טרי. פרוטוקול יכול לשמש גם לתכנת מחדש PBMCs הקפוא (מתקבל ישירות מהמעייל באפים), פירוט של השלכות מעשיות משמעותיות כאשר ניצול תאי תורם נרכשו ממיקום מרוחק. לפני הג?…
The authors have nothing to disclose.
מחקרים אלו מומנו בחלקו פרס NIH UO1HL107443-01 לGJM ו-GM על ידי.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
IMDM | Invitrogen | 12440 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
SCF | R&D Systems | 255-SC | |
EPO | R&D Systems | 286-EP | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Polybrene | Sigma | H-9268 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |