Samtidig Elektroencefalografi, Real-time måling af laktat Koncentration og Optogenetic Manipulation af neuronale aktivitet i Rodent Cerebral Cortex
Summary
En procedure er beskrevet for at manipulere med aktiviteten af cerebrale kortikale pyramidale neuroner optogenetically mens elektroencefalogram, electromyogram, og cerebral laktat koncentration overvåges. Eksperimentelle optagelser udføres på kabel-forankrede mus, mens de gennemgår spontane søvn / vågner cyklusser. Optogenetic udstyr samles i vores laboratorium, kontrolapparatet er kommercielt tilgængeligt.
Abstract
Selvom hjernen udgør mindre end 5% af kroppen efter vægt, den udnytter omkring en fjerdedel af glucose som kroppen i hvile 1. Funktionen af non rapid eye movement søvn (NREMS), den største del af søvn ved tiden, er usikker. Men et iøjnefaldende træk ved NREMS er en væsentlig reduktion i forekomsten af cerebral glucoseudnyttelse i forhold til vågenhed 2-4. Dette og andre fund har ført til den udbredte opfattelse, at søvnen har en funktion relateret til cerebral metabolisme. Men de underliggende mekanismer reduktion i cerebral glucosemetabolisme i NREMS stadig at blive belyst.
Et fænomen forbundet med NREMS, der kan påvirke cerebral stofskifte er forekomsten af langsomme bølger, svingninger ved frekvenser på mindre end 4 Hz, i elektroencefalogram 5,6. Disse langsomme bølger detekteret på niveauet af kraniet eller cerebrale kortikale overflade afspejlersvingninger af underliggende neuroner mellem en depolariseret / op stat og en hyperpolariseret / ned tilstand 7. Under ned tilstand, behøver celler ikke undergå aktionspotentialer i intervaller på op til adskillige hundrede millisekunder. Restaurering af ioniske koncentrationsgradienter efterfølgende til virkningspotentialer udgør en væsentlig metabolisk belastning af cellen 8 fravær af virkningspotentialer under ned associeret med NREMS kan bidrage til nedsat metabolisme i forhold til at vågne.
To tekniske udfordringer skulle løses for at denne hypotetiske forhold, der skal testes. For det første var det nødvendigt at måle cerebral glycolytisk metabolisme med en tidsmæssig opløsning reflekterende af dynamikken i den cerebrale EEG (dvs. i løbet sekunder i stedet for minutter). For at gøre dette, målte vi koncentrationen af lactat, produktet af aerobe glycolyse, og derfor en udlæsning af den mængde glucose metabolisme i hjernerne hos mus. Lactat blevmåles under anvendelse af en lactatoxidase baseret realtid sensor indlejret i den frontale cortex. Den følende mekanisme består af en platin-iridium elektrode omgivet af et lag af lactatoxidase molekyler. Metabolisme af lactat af lactatoxidase producerer hydrogenperoxid, som frembringer en strøm i platin-iridium elektrode. Så en rampe op af cerebral glycolyse tilvejebringer en stigning i koncentrationen af substrat for lactatoxidase, som derefter afspejles i øget strøm ved måleelektroden. Det var desuden nødvendigt at måle disse parametre, samtidig med at manipulere ophidselse af den cerebrale cortex, for at isolere denne variabel fra andre aspekter af NREMS.
Vi udtænkte et eksperimentelt system til samtidig måling af neuronal aktivitet via elecetroencephalogram, måling af glycolytisk flux via en lactat biosensor, og manipulation af cerebral cortical neuronal aktivitet via optogenetic aktivering af PyraMIDAL neuroner. Vi har udnyttet dette system til at dokumentere forholdet mellem søvn-relateret elektroencephalografisk bølgeformer og de øjeblik til øjeblik dynamik laktat koncentration i hjernebarken. Protokollen kan være nyttige for enhver person interesseret i at studere i frit opfører gnavere, forholdet mellem neuronal aktivitet målt på elektroencephalografisk niveau og cellulære energetik i hjernen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåderne præsenteres her, at man kan måle forholdet mellem søvn og ændringer i hjernen koncentrationen i den glycolytiske mellemprodukt lactat på en tidsskala ikke tidligere var muligt. Dyr gennemgå spontane overgange mellem kølvand, NREMS og REMS. Desuden er vi i stand til at anvende optogenetic stimuli, mens dyrene gennemgå disse overgange. Data indsamlet indtil nu viser, at både spontane og inducerede bølger indvirkning på udlæsningen af en lactatoxidase-baseret biosensor.
<p class="jov…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning finansieret af Department of Defense (Defense Advanced Research Projects Agency, Young Faculty Award, Grant Number N66001-09-1-2117) og NINDS (R15NS070734).
Materials
| Component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. |
Riferimenti
- Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).
- Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
- Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
- Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
- Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
- Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
- Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
- Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
- El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
- Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
- Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscienze. 92 (2), 427-443 (1999).
- Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
- Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).
