Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת
Summary
הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.
Abstract
למרות שהמוח מהווה פחות מ 5% מהגוף על ידי מסה, היא מנצלת כרבע מגלוקוז בשימוש על ידי הגוף במנוחה 1. הפונקציה של שינה ללא תנועת עיניים מהירות (NREMS), החלק הגדול ביותר של שינה בזמן, אינה ודאית. עם זאת, מאפיין בולט אחד NREMS הוא ירידה משמעותית בשיעור ניצול הגלוקוז במוח ביחס לערות 2-4. זה וממצאים אחרים הוביל לאמונה מרוויחה כי שינה ממלאת תפקיד הקשור לחילוף חומרים במוח. ובכל זאת, את המנגנונים בבסיס הירידה בחילוף חומרים של הגלוקוז במוח במהלך NREMS יישארו להובהרו.
תופעה אחת קשורה NREMS שעשוי להשפיע על קצב חילוף חומרים במוח היא המופע של גלים איטיים, תנודות בתדרים של פחות מ 4 רץ, באלקטרו 5,6. גלים איטיים אלו שאותרו ברמה של הגולגולת או משטח קליפת מוח מוחות משקפיםתנודות של נוירונים בסיסיים בין מדינת depolarized / ומדינה hyperpolarized / למטה 7. במהלך את המדינה, תאים אינם עוברים פוטנציאלי פעולה למרווחים של עד כמה אלפיות שניים 100. שיקום הדרגתי ריכוז יוני עוקבים לפוטנציאל פעולה מייצג עומס מטבולים משמעותי על התא 8; העדר פוטנציאל פעולה במצבים למטה קשורים NREMS עשוי לתרום לחילוף חומרים יחסית להעיר מופחת.
שני אתגרים טכניים היו צריכים טיפול במסגרת מערכת היחסים ההיפותטי הזה כדי להיבדק. ראשית, היה צורך למדוד את חילוף חומרי glycolytic מוחות עם רזולוציה משקפת את הדינמיקה של EEG המוחי זמנית (כלומר, על שניות ולא דקות). כדי לעשות זאת, מדדה את הריכוז של חומצת חלב, התוצר של הגליקוליזה אירובית, ולכן readout של קצב חילוף חומרים של הגלוקוז במוחם של עכברים. קטט היהנמדד באמצעות חיישן קטט מונואמין מבוסס זמן אמת הגלומה בקליפת המוח הקדמית. מנגנון החישה מורכבת מאלקטרודה הפלטינה אירידיום המוקף בשכבה של מולקולות מונואמין קטט. חילוף חומרים של חומצת חלב על ידי מונואמין קטט מייצר מי חמצן, שמייצר זרם באלקטרודה הפלטינה אירידיום. אז ramping את הגליקוליזה המוח מספק עלייה בריכוזו של המצע למונואמין חומצת החלב, אשר לאחר מכן בא לידי ביטוי בעלייה נוכחית בהאלקטרודה החישה. זה היה בנוסף צורך למדוד המשתנים הללו תוך מניפולצית העירור של קליפת המוח, כדי לבודד את המשתנה הזה מהיבטים אחרים של NREMS.
אנחנו פתחנו מערכת ניסיונית למדידה בו זמנית של פעילות עצבית דרך elecetroencephalogram, מדידת שטף glycolytic דרך biosensor חומצת חלב, והמניפולציה של פעילות עצבית בקליפת מוח מוח באמצעות הפעלת optogenetic של Pyraהנוירונים midal. יש לנו מנוצלים במערכת זו כדי לתעד את היחסים בין צורות גל שינה הקשורות electroencephalographic ואת הדינמיקה מהרגע לרגע של ריכוז חומצת חלב בקליפת המוח. הפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור כל אדם המעוניין ללמוד, במכרסמים מתנהגים בחופשיות, קשר בין הפעילות עצבית שנמדדה ברמת electroencephalographic והאנרגטיקה סלולרית בתוך המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות שהוצגו כאן מאפשרים אחד כדי למדוד את הקשר בין שינה ושינויים בריכוז המוח של חומצת חלב ביניים glycolytic על ציר זמן אינו אפשרי בעבר. בעלי חיים עוברים מעברים ספונטניים בין התעוררות, וNREMS REMS. יתר על כן, אנו מסוגלים להחיל גירויי optogenetic תוך חיים עוברים המעברים האלה. נתונים ש…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר מומן על ידי משרד ההגנה (ביטחון סוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם, פקולטת פרס צעיר, מספר גרנט N66001-09-1-2117) וNINDS (R15NS070734).
Materials
| Component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. |
Riferimenti
- Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).
- Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
- Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
- Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
- Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
- Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
- Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
- Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
- El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
- Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
- Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscienze. 92 (2), 427-443 (1999).
- Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
- Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).
