Samtidig Elektroencefalografi, realtidsmätning av laktat koncentration och optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet hos gnagare Cerebral Cortex
Summary
Ett förfarande beskrivs för att manipulera aktiviteten hos cerebrala kortikala pyramidala nervceller optogenetically medan elektroencefalogram, elektromyogram, och cerebral laktatkoncentrationen övervakas. Experimentella inspelningar utförs på kabel-bundna möss medan de genomgår spontana Sleep / Wake-cykler. Optogenetic utrustning monteras i vårt laboratorium, färdskrivare är kommersiellt tillgänglig.
Abstract
Även hjärnan utgör mindre än 5% av kroppens vikt, utnyttjar det ungefär en fjärdedel av den glukos som används av kroppen i vila 1. Funktionen av icke rapid eye movement sleep (NREMS), den största delen av sömn efter tid, är osäkert. Emellertid, är en framträdande egenskap hos NREMS en betydande minskning i hastigheten av cerebral glukosanvändning relativt vakenhet 2-4. Detta och andra fynd har lett till den vitt spridda uppfattningen att sömnen tjänar en funktion relaterad till cerebral metabolism. Men de mekanismer som ligger bakom minskningen av cerebral glukosmetabolism under NREMS återstår att klarlägga.
Ett fenomen i samband med NREMS som kan påverka cerebral ämnesomsättning är förekomsten av långsamma vågor, svängningar vid frekvenser mindre än 4 Hz i elektroencefalogram 5,6. Dessa långsamma vågor detekteras i nivå med skallen eller cerebrala kortikala ytan återspeglarsvängningar underliggande neuroner mellan en depolariserad / upp tillstånd och en hyperpolariserad / ned-läge 7. Under ned-läge, inte genomgår celler inte aktionspotentialer för intervaller på upp till flera hundra millisekunder. Restaurering av joniska koncentrationsgradienter efter det att aktionspotentialer innebär en betydande metabolisk belastning på cellen 8, avsaknad av aktionspotentialer vid ned associerade med NREMS kan bidra till minskad ämnesomsättning i förhållande till vakna.
Två tekniska utmaningar måste lösas för att denna hypotetiska relation som ska testas. Först var det nödvändigt att mäta cerebral glykolytiska metabolismen med en tidsupplösning reflekterande av dynamiken i den cerebrala EEG (dvs över sekunder snarare än minuter). För att göra det, mätte vi koncentrationen av laktat, produkten av aerob glykolys, och därför en avläsning av graden av glukosmetabolismen i hjärnan hos möss. Laktat varmäts med en laktatoxidas baserad realtid sensor inbyggd i frontala cortex. Den avkännande mekanism består av en platina-iridium elektrod omgiven av ett skikt av laktatoxidas molekyler. Metabolism av laktat genom laktatoxidas producerar väteperoxid, som alstrar en ström i platina-iridium elektrod. Så en upprampning av cerebral glykolys ger en ökning i koncentrationen av substratet för laktatoxidas, som sedan återspeglas i ökad ström vid den avkännande elektroden. Det var dessutom nödvändigt att mäta dessa variabler samtidigt manipulera retbarhet av hjärnbarken, i syfte att isolera denna variabel från andra aspekter av NREMS.
Vi utarbetat ett experimentellt system för samtidig mätning av neuronal aktivitet via elecetroencephalogram, mätning av glykolytiska flödet via en laktat biosensor, och manipulation av cerebral kortikal neuronal aktivitet genom optogenetic aktivering av pyraMIDAL nervceller. Vi har använt detta system för att dokumentera sambandet mellan sömn-relaterade elektroencefalografiska vågformer och ögonblicket till ögonblick dynamik laktat koncentration i hjärnbarken. Protokollet kan vara användbar för varje enskild person intresserad av att studera i fritt beter gnagare, förhållandet mellan neuronal aktivitet mätt vid elektroencefalografiska nivå och cellulära energier i hjärnan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoderna som presenteras här tillåter en att mäta förhållandet mellan sömn och förändringar i hjärnan koncentrationen av glykolytiska mellanliggande laktat på en tidsskala inte varit möjligt. Djur genomgår spontana övergångar mellan vakna, NREMS och REMS. Dessutom kan vi använda optogenetic stimuli medan djur genomgår dessa övergångar. Data som samlats in hittills visar att både spontan och inducerad vågor påverkar avläsning av en laktatoxidas-baserad biosensor.
Man ka…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som finansieras av Department of Defense (Defense Advanced Research Projects Agency, ung fakulteten Award, licensnummer N66001-09-1-2117) och NINDS (R15NS070734).
Materials
| Component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. |
Riferimenti
- Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).
- Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
- Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
- Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
- Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
- Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
- Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
- Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
- El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
- Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
- Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscienze. 92 (2), 427-443 (1999).
- Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
- Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).
