ここでは、人工抗原提示細胞(AAPC)を使用してバルクT細胞集団から、ヒトNKT細胞を活性化し、拡大するための方法を説明します。 CD1dのベースAAPCの使用は、機能的なNKT細胞の高い数値を生成するための標準化された方法を提供します。
ナチュラルキラーT(NKT)細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞やT細胞1の両方の特徴的なマーカーが表示され、T細胞のユニークなサブセットです。古典的T細胞とは異なり、NKT細胞はCD1分子2のコンテキストで脂質抗原を認識する。 NKT細胞は、不変のTCRα鎖転位表現:ヒト、マウスにおけるVα14Jα18とVα24Jα18、限られた多様性3-6Vβチェーンに関連付けられているため、正規または不変のNKT(ⅰNKT)細胞と呼ばれています。従来のT細胞と同様に、NKT細胞は、CD1dの7による適切なシグナリング以下、CD4-CD8-胸腺T前駆細胞から発生する。治療目的のためにNKT細胞を活用する可能性は大幅にα-ガラク(α-トシルセラミド)やサイトカイン8の様々なヒトNKT細胞を刺激して展開する能力を増加している。重要なのは、これらの細胞は元phenotypを保持電子、分泌されるサイトカイン、腫瘍細胞株に対する細胞傷害機能表示。このように、ex vivoで展開されたNKT細胞が機能していると、養子免疫療法に使用することができます。しかし、NKT細胞ベース – 免疫療法は、自己抗原提示細胞の使用によって制限されており、これらの刺激細胞の量と質は大幅に異なる場合があります。癌患者由来の単球由来のDCは共刺激分子のレベル低下を発現し、9,10未満炎症性サイトカインを産生することが報告されている。実際には、むしろ自己のAPCよりマウスDCは、CML患者11からNKT細胞の機能をテストするために使用されている。 NKT細胞がマウスDCによって展開してから、養子免疫療法に使用することはできませんので、しかし、このシステムは唯一のin vitro試験に用いることができる。このように、人工抗原提示細胞(AAPC)に依存して標準化されたシステムは、同種または異種のCEの落とし穴ずにDCの刺激効果を作り出すことができるLLS 12、13。ここで、我々はCD1dのベースAAPCを生成する方法を説明します。 CD1dの抗原複合体によるT細胞受容体(TCR)の係合は、NKT細胞の活性化、抗原の基本的な要件であるので:CD1dの-Igの複合体は、隔離し、アクティブ化、およびエフェクターNKT細胞集団を展開する信頼性の高い方法を提供します。
AAPCは、NKT細胞の活性化のための基本的な要件を研究するために使用され、それは養子免疫療法のためのNK T細胞の ex vivo での拡張のための潜在的な臨床的価値を持つことができます。 Mescher らは、ビオチン化マウスMHCクラスI-ペプチド単鎖コンストラクトはラテックスミクロス14,15の表面にストレプトアビジンを介してビオチン化された共刺激分子B7.1およびB7.2と結合された第1ビードベースのシステムで、次のいずれかを記述した。このアプローチが成功したトランスジェニックマウスから抗原特異的T細胞を刺激するために使用されてきました。このアプローチは、MHC分子の均一な荷重を確実にするために、単鎖MHC-ペプチド複合体を使用しているので、さらに、それぞれの標的ペプチド抗原はこうしての一般性を制限することは、所望の一本鎖MHC-ペプチド複合体の発現のための新たなトランスフェクションを必要とするであろうアプローチ。重要なのは、博士シュネックのグループは、別の非細胞ビーズをベースAAPCを開発することによって、ビーズに基づく-AAPC先駆け、磁気ビーズにHLA-Igは、信号1、抗CD28、信号2を、結合させることによって行った。 HLA-Igは、免疫グロブリン分子足場16,17に融合されたHLAのユニークな多量体形態は、彼のグループによって開発されました。その後、彼らは効果的にCMVおよびMART-1特異的CTL 18を拡大することが示されているMHC-IgをベースAAPCを開発しました。ここでは、CD1dの-IgをベースAAPCは、機能的にNKT細胞を拡大するために使用することができることを実証した。ある研究では、CD1dの19とNK細胞の物理的相互作用を調べるために同様のシステムを使用しています。
特に、我々は最適なNKT細胞の増殖に必要な発見した要件に合わせることができます人工抗原提示細胞を設計しました。 AAPC展開法は、ヒトNKT細胞を拡大し、充実させるための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。当社AAPCは、体系的潜在的な共刺激分子のパネルの役割を評価するとNKT細胞prolifera上の自分の役割を評価するために変更することができますると機能。したがって、AAPCは、NKT細胞を誘導し、拡大するための有用な堅牢な汎用性の高い技術を表しています。 AAPCSの世代が1週間未満を取り、ビーズの大量生産に適しています。しかし、AAPCを生成するための重要なステップは、CD1dの-Igは安定したビーズの表面に固定化されていることを確認し、バッチ毎に一貫性を確保するため、その機能を評価することである。システムの潜在的な制限は、ビーズの機械的な除去以外に、刺激をオフにするために設けられているメカニズムがないことです。具体的には、抗原とT細胞受容体(TCR)の係:CD1d/MHC複合体は、一般的にT細胞の両方の阻害または抑制因子の誘導につながることができます付属品/接着分子とのコンサートにおける免疫シナプスを生成抗原が提示細胞。 AAPCシステムでは、これらの要因は、T細胞によってアップレギュレートされるかもしれませんが、ビーズは同族リガンドを発現していますこれらの受容体のために。
また、CD4 + NKT細胞がマウスとヒトでの抗腫瘍反応を抑制することが示されている、したがって、それはすべてのNKT細胞(α-GalCerを持つすなわちグローバル刺激)または間違ったサブセットの活性化の非選択的な活性化が不要な免疫学的につながる可能性があります成果。その結果、1は、表現型および機能的にAAPC膨張したNKT細胞集団を特徴づける必要があります。 図4に示すように、我々は、抗CD28を発現しているα-GalCerを負荷されたAAPCの刺激は、Th2 Th1細胞を産生するNKT細胞、とTh17型サイトカインをもたらすことができることを発見した。マウスの研究では、IL-33で挑戦することを報告している、最近同定されたサイトカインは、例えば、IL-5およびIL-13などの炎症性サイトカインの循環レベルの増加をもたらした。 IL-33とNKT細胞の治療は、それらのサイトカイン産生20を強化しました 。 IL-33はST2に特異的なリガンドであり、それは、可溶性ST2 CAが示されているnブロックのIL-33シグナル伝達。したがって、将来のアプリケーションの例として、AAPC表現するST2が生成され、NKT細胞によるTh1サイトカイン分泌を誘導する一方が選択的にTh2サイトカインの産生を抑制することができるかどうかを判断するために使用することができる。また、C57BL / 6マウスに発現しているKB-AAPCの静脈注射は、腫瘍21の減少、肺転移が生じていること。報告されている重要なことは、これらのデータは、肺にそのAAPCトラフィックを発揮し、エフェクターT細胞サブセットをアクティブにすることができます。したがって、1はAAPC複数のタイプを生成し、抗原特異的T細胞サブセットの間の相互作用を調べることができます。要約すると、これらの研究は、CD1dの-IgをベースAAPCは、正常な細胞APCを置き換えるために使用できることを実証し、NKT細胞ベース – 養子免疫療法のために現在の臨床的アプローチを強化するための潜在的に持っている。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、有用な議論Priyankaスブラマニヤムに感謝したいと思います。著者らは金銭的利害が競合していない。この作品は、アメリカ癌協会は、NIH / NCI K01 CA131487、R21 CA162273、R21 CA162277、およびP30腫瘍免疫学およびTJウェッブへの免疫療法·プログラムからの補助金によって支えられている。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立癌研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |