Her beskriver vi en fremgangsmåte for å aktivere og utvide humane NKT celler fra bulk T celle populasjoner ved hjelp av kunstig antigenpresenterende celler (AAPC). Bruken av CD1d-baserte AAPC gir en standardisert metode for å generere høye antallet funksjonelle NKT-celler.
Naturlig killer T (NKT) celler er en unik undergruppe av T-celler som viser markører karakteristiske av både naturlige killer (NK) celler og T-celler 1. Motsetning klassiske T celler, NKT celler gjenkjenner lipid antigen i sammenheng med CD1 molekyler 2. NKT-celler uttrykker en invariant TCRα kjede omleiring: Vα14Jα18 i mus og Vα24Jα18 i mennesker, som er forbundet med Vβ kjeder av begrenset mangfold 3-6, og er referert til som kanoniske eller invariant NKT (i NKT) celler. I likhet med konvensjonelle T-celler, NKT-celler utvikles fra CD4-CD8-thymus forløperen T-celler etter den riktige signaler ved CD1d 7. Muligheten til å utnytte NKT celler for terapeutiske formål har betydelig økt med evnen til å stimulere og utvide humane NKT celler med α-Galactosylceramide (α-GalCer) og en rekke cytokiner 8. Viktigere, beholdt disse cellene deres opprinnelige phenotype, utskilte cytokiner og fremviste cytotoksisk funksjon mot tumorcellelinjer. Således, ex vivo utvidede NKT celler forblir funksjonelle og kan brukes for adoptiv immunterapi. Imidlertid har NKT celle basert-immunterapi vært begrenset ved bruk av autologe antigenpresenterende celler og mengden og kvaliteten av disse stimulator celler kan variere betydelig. Monocytt-avledet DC fra kreftpasienter har blitt rapportert å uttrykke reduserte nivåer av costimulatory molekyler og produserer mindre inflammatoriske cytokiner 9,10. Faktisk har murine DC fremfor autolog APC blitt brukt for å teste funksjonen av NKT celler fra CML pasienter 11. Imidlertid kan dette systemet bare brukes for di vitro testing siden NKT cellene ikke kan utvides ved muse DC og deretter brukt for adoptiv immunterapi. Dermed kunne et standardisert system som er avhengig av kunstige antigenpresenterende celler (AAPC) produserer den stimulerende effekten av DC uten fallgrubene allo-eller xenogeneiske ce12 LLS, 13 år. Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for å generere CD1d-baserte AAPC. Siden engasjement av T-celle reseptor (TCR) ved CD1d-antigen komplekser er et grunnleggende krav i NKT celleaktivering, antigen: CD1d-Ig komplekser gir en pålitelig metode for å isolere, aktivere og utvide effektor NKT celle populasjoner.
AAPC kan brukes til å studere de grunnleggende krav til NKT celle aktivering og det har potensiale klinisk verdi for ex vivo ekspansjon av NK T celler for adoptiv immunterapi. Mescher et al. Beskrev en av de første bead baserte systemer, hvor biotinylert murint MHC klasse I-peptid-enkelt kjede konstruerer ble kombinert med biotinylerte costimulatory molekyler B7.1 og B7.2 via streptavidin til overflaten av lateks 14 mikrokuler, 15. Denne tilnærmingen har med hell blitt brukt til å stimulere antigen-spesifikke T-celler fra transgene mus. I tillegg, siden denne tilnærmingen benytter en enkelt kjede MHC-peptid kompleks å sikre homogen lastingen av MHC molekyler, ville hver målpeptidet antigen krever nytt transfeksjon for ekspresjon av det ønskede enkeltkjedet MHC-peptid kompleks, og dermed begrense allmenngyldigheten av det tilnærming. Viktigere, pioner Dr. Schneck gruppe perlen baserte-AAPC, ved å utvikle en annen ikke-cellulær perle basert AAPC, Laget ved kobling HLA-Ig, signal 1, og anti-CD28, signal 2, bort magnetiske perler. HLA-Ig, en unik multimeric form for HLA smeltet til et immunglobulin molekylær 16 stillaset, 17 ble utviklet av sin gruppe. Deretter, utviklet de MHC-Ig basert AAPC, som har vist seg å effektivt utvide CMV og MART-1 spesifikk CTL 18. Her har vi demonstrert at CD1d-Ig basert AAPC kan brukes til å utvide funksjonelle NKT-celler. En studie har brukt et lignende system for å undersøke den fysiske interaksjonen av NK-celler med CD1d 19.
Spesielt har vi utviklet en kunstig antigen presentasjon celle som er tilpasningsdyktig til eventuelle krav vi finner nødvendig for optimal NKT celleproliferasjon. Den AAPC utvidelse metoden gir en enkel og pålitelig metode for å utvide og berike menneskelige NKT-celler. Vår AAPC kan endres til systematisk vurdere rollen et panel av potensielle costimulatory molekyler og vurdere sin rolle på NKT celle proliferasjon og funksjon. Dermed AAPC representerer en robust allsidig teknologien nyttig for å indusere og utvide NKT-celler. Generering av aAPCs tar mindre enn en uke og er egnet for produksjon av store mengder av perler. Imidlertid, er et kritisk trinn i å generere AAPC å bekrefte at CD1d-Ig er stabilt immobilisert på overflaten av kulene og for å vurdere deres funksjonalitet for å sikre konsistens fra parti til parti. En potensiell begrensning av systemet er at det ikke er en mekanisme på plass for å slå av stimulering, annet enn mekanisk fjerning av kulene. Spesifikt, engasjement av T-celle reseptor (TCR) med antigen: CD1d/MHC kompleks typisk generere immunologiske synapse i konsert med tilbehør / adhesjonsmolekyler, som kan resultere i induksjon av hemmende eller undertrykkende forhold både på T-celle og antigenpresenterende celle. I AAPC systemet kan disse faktorene blir oppregulert av T celle, men vulsten vil ikke uttrykke beslektede liganderfor disse reseptorene.
I tillegg har CD4 + NKT-celler vist seg å undertrykke antitumor responser i mus og mennesker, derfor er det mulig at ikke-selektive aktivering av alle NKT celler (dvs. Global stimulering med α-GalCer) eller aktivering av feil delsett kan resultere i uønsket immunologiske utfall. Følgelig må en fenotypisk og funksjonelt karakterisere AAPC ekspanderte NKT cellepopulasjon. Som vist i figur 4, har vi funnet at stimulering med α-GalCer-loaded AAPC uttrykke anti-CD28 kan resultere NKT celler som produserer TM1, TM2, og Th17 attraksjon cytokiner. Murine studier har rapportert at utfordringen med IL-33, en nylig identifisert cytokin, resulterte i økte nivåer av sirkulerende inflammatoriske cytokiner som IL-5 og IL-13. Behandling av NKT-celler med IL-33 forbedret sin cytokin produksjon 20. IL-33 er en spesifikk ligand for ST2 og det har blitt vist at løselig ST2 can blokk IL-33 signalering. Således, som et eksempel på en fremtidig anvendelse, kunne AAPC uttrykke ST2 genereres og brukes for å bestemme om en kan selektivt hemme produksjonen av Th2-cytokiner mens inducing Th1 cytokin sekresjon av NKT-celler. Det har også blitt rapportert at iv injeksjon av Kb-uttrykke AAPC inn C57BL / 6 mus resulterte i redusert lunge metastasering av tumor 21. Viktigere, Disse data viser at AAPC trafikk til lungen og er i stand til å aktivere T-celle-effektor undergrupper. Derfor kan man generere flere typer AAPC og undersøke samspillet mellom antigen spesifikke T celle undergrupper. For å oppsummere, disse studiene viser at CD1d-Ig basert AAPC kan brukes til å erstatte normal mobilnettet APC, og må potensial til å forbedre nåværende kliniske tilnærminger for NKT celle basert-adoptiv immunterapi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Priyanka Subrahmanyam for personer diskusjoner. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomisk interesse. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, CA162277, R21 og P30 Tumor Immunologi og Immunterapi Program til TJ Webb. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle utsikt over National Cancer Institute eller National Institutes of Health.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |